阿奇霉素對哮喘大鼠瘦素表達及氣道炎癥的影響

朱述陽，嵇桂娟，盧立國，閆明華，段存玲，張文輝，卞 宏

（1.徐州醫學院附屬醫院呼吸內科，江蘇徐州221006；2.江蘇省沭陽縣人民醫院呼吸科 223600）

哮喘是多種細胞和細胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病。氣道平滑肌細胞（airway smooth muscle cells，ASMC）在哮喘的發病機制中的作用被越來越多的研究發現［1］。研究表明肥胖患者哮喘發病率增加，且癥狀嚴重，對治療不敏感，肥胖哮喘小鼠氣道炎癥和反應性明顯高于非肥胖哮喘小鼠［2］。瘦素是由脂肪細胞分泌的一種蛋白質，其受體在肺組織中有廣泛的表達，其能夠獨立于肥胖而調節氣道炎癥反應［3］。大環內酯類抗菌藥物在支氣管哮喘中治療作用得到越來越多研究證實［4］。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 卵清清蛋白（ovalbumin，OVA，美國Sigma公司），阿奇霉素（天津市生物化學制藥廠，批號：國藥準字H20020293），DMEM培養基（Gibco公司），20%小牛血清（杭州四季青公司），瘦素酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），一抗（兔抗大鼠leptin IgG，1∶100稀釋，武漢博士德生物有限公司），二抗（羊抗兔IgG，1∶200稀釋，北京中杉金橋生物技術有限公司），4-羥乙基哌嗪乙磺酸｛［4-（2-hydroxyerhyl）-1-piperazinyl］ethanesulfonic acid，HEPES｝，100U／mL 青 霉素、鏈霉素等。

1.2 大鼠肥胖模型的建立 參照文獻［5］建立大鼠肥胖模型，選擇雌性4周齡SD大鼠48只，SPF級，體質量（76～81）g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。適應性飼養1周后，將48只大鼠隨機分為體質量正常組24只，喂食基礎飼料，每100g提供能量1 697.1kJ；體質量肥胖組24只，喂食高能飼料，每100 g提供能量1 951.7kJ，其中35%的能量由脂肪提供。兩組均不銹鋼籠單籠飼養，12h光照／12h黑暗，室溫22～25℃，濕度40%～70%，自由飲蒸餾水，人為控制大鼠攝食量，并記錄每日攝食量和撒食量，每周稱重，喂養7周。以超過正常大鼠體質量1／3為肥胖標準。

1.3 大鼠哮喘模型的建立 將體質量正常組再分為正常對照組、正常哮喘組和正常干預組。體質量肥胖組再分為肥胖對照組、肥胖哮喘組和肥胖干預組，每組8只。參照文獻［6］并加以改進制備大鼠哮喘模型：正常哮喘組、正常干預組、肥胖哮喘組和肥胖干預組大鼠于喂養7周后，第1天腹腔注射含有1mg OVA和20μg氫氧化鋁的生理鹽水0.5mL，并于第8天重復注射1次。自第15天開始給予1%OVA霧化吸入，每天1次，每次30min，持續3d；正常干預組和肥胖干預組在每次霧化前30min腹腔注射阿奇霉素，劑量按1.75mg·kg-1·d-1，溶解于0.5mL生理鹽水中；正常哮喘組、肥胖哮喘組以生理鹽水代替。正常對照組、肥胖對照組以生理鹽水代替OVA致敏和激發。

1.4 ASMC的培養及鑒定 肥胖模型以及哮喘模型復制成功后，處死大鼠，迅速無菌分離大鼠的氣道平滑肌組織，采用組織貼塊法培養原代ASMC，胰酶消化法傳代并自然純化，實驗用4～6代。取第4代培養的大鼠ASMC，制成單細胞懸液接種于96孔培養板，37℃，5%CO2培養24h，正常哮喘組、正常干預組、肥胖哮喘組和肥胖干預組分別給予含致敏老鼠血清的培養液，正常對照組和肥胖對照組給予含0.1%胎牛血清的培養液繼續培養48h，正常干預組和肥胖干預組給予達氏修正依氏培養基（dulbecco′s modified eagle′s medium，DMEM）稀釋的阿奇霉素（10-5M）。培養的正常對照組ASMC經形態學觀察和免疫組織化學染色法測α肌動蛋白（α-actin）的表達進行細胞的鑒定。

1.5 標本采集及處理 取心臟血2mL，分離血清分裝，-80℃保存備用。用PBS灌洗左肺，反復3次，回收率在80%以上視為成功。計數支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）白細胞總數和中性粒細胞數目，4℃下，2 500r／min離心15min，取上清液，-80℃保存備用。取右肺組織，迅速放入液氮冷凍后，保存在-80℃冰箱中用于Western blot測定，取左肺組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、切片、HE染色。ASMC干預培養24h后，取上清液離心后-20℃低溫保存備用。

1.6 血清、BALF及細胞上清液中瘦素濃度測定 參照試劑盒說明書操作，測吸光度值（A450nm），通過標準曲線計算血清、BALF及細胞上清液中瘦素的濃度。

1.7 肺組織中瘦素蛋白含量測定 1mg肺組織中加入6μL尿素裂解緩沖液，置冰上1h，每15min渦旋1次，4℃下，10 000r／min離心1h，取上清液，以牛血清清蛋白為標準品測定蛋白濃度。150μg蛋白加入十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液，置沸水中加熱5min。經10%SDS-PAGE電泳分離后，以半干轉移法轉至硝酸纖維膜上。室溫封閉1h，加入一抗，4℃過夜，再加入二抗，室溫孵育2h，顯色1～2h后終止。以大鼠β肌動蛋白（β-actin）作內參照。以目的蛋白與β-actin吸光度值的比值進行半定量分析。

1.8 大鼠ASMC內瘦素蛋白含量測定 將細胞制成單細胞懸液后，按細胞數1×107接種于6孔細胞培養板中，37℃、50 mL／L CO2培養24h，待細胞生長融合后收集蛋白，Western blot分別檢測細胞內瘦素蛋白的含量。

1.9 統計學處理 應用SPSS13.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示。采用單因素方差分析比較各組均數總的差異，q檢驗進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 阿奇霉素對肥胖哮喘模型大鼠肺組織病理變化的影響正常對照組和肥胖對照組大鼠肺組織可見黏膜上皮細胞完整，管腔中無黏液分泌，管壁無炎癥細胞浸潤；正常哮喘組和肥胖哮喘組大鼠肺組織顯示黏膜上皮局部脫落，黏膜下水腫，黏液腺增生，杯狀細胞增多，管壁各層均可見炎癥細胞浸潤；正常干預組和肥胖干預組大鼠肺組織炎癥細胞浸潤減輕，見圖1。

圖1 6組大鼠肺組織病理表現影像（免疫組織化學染色，×400）

2.2 ASMC的鑒定 培養的ASMC呈梭形，平行生長，束狀排列，密集與稀疏處相互交錯呈“峰谷”狀。免疫細胞化學檢測法表明，抗平滑肌α-actin抗體呈陽性染色即胞質內可見大量綠色熒光，證實所養細胞為ASMC。見圖2～3。

2.3 6組大鼠BALF中白細胞總數和中性粒細胞數 正常干預組、肥胖干預組BALF中白細胞總數、中性粒細胞計數明顯低于正常哮喘組及肥胖哮喘組（P＜0.05）。正常哮喘組和肥胖哮喘組分別較正常對照組和肥胖對照組均有所升高，肥胖哮喘組較正常哮喘組升高（P＜0.05）。見表1。

圖2 培養的第4代ASMC影像（倒置顯微鏡，×100）

圖3 ASMC抗α-actin免疫熒光細胞化學影像（倒置顯微鏡，×400）

表1 各組大鼠BALF中白細胞總數和中性粒細胞計數的比較（±s，×104／mL）

表1 各組大鼠BALF中白細胞總數和中性粒細胞計數的比較（±s，×104／mL）

＊：P＜0.05，與正常對照組比較；＃：P＜0.05，與正常哮喘組比較；▲：P＜0.05，與正常干預組比較；☆：P＜0.05，與肥胖對照組比較；★：P＜0.05，與肥胖哮喘組比較。

組別 n 白細胞總數 中性粒細胞正常對照組8 48.0±6.7 1.89±0.55正常哮喘組 8 80.3±5.6＊ 2.59±0.72＊正常干預組 8 35.4±5.0＃ 2.37±0.79＊肥胖對照組 8 63.9±6.6＊▲ 2.52±0.69＊▲肥胖哮喘組 8 116.5±13.6＃☆▲＊ 14.47±1.25＃☆▲＊肥胖干預組 8 65.4±7.2★▲ 7.23±0.90★▲＃

2.4 各組大鼠肺組織瘦素蛋白表達、血清、BALF及細胞上清液中瘦素濃度的比較 血清和BALF及培養的ASMC上清液中瘦素濃度，肥胖哮喘組瘦素表達高于正常哮喘組，同時正常哮喘組和肥胖哮喘組分別高于正常對照組和肥胖對照組（P＜0.05），正常干預組和肥胖干預組瘦素表達明顯低于正常哮喘組和肥胖哮喘組（P＜0.05）。見表2～3和圖4～5。

表2 6組大鼠血清、BALF和細胞上清液中瘦素濃度的比較（±s，pg／mL）

表2 6組大鼠血清、BALF和細胞上清液中瘦素濃度的比較（±s，pg／mL）

＊：P＜0.05，與正常對照組比較；＃：P＜0.05，與正常哮喘組比較；▲：P＜0.05，與正常干預組比較；☆：P＜0.05，與肥胖對照組比較；★：P＜0.05，與肥胖哮喘組比較。

組別 n 血清 BALF 上清液中正常對照組8 31.7±1.0 10.4±0.8 1 321.2±17.4正常哮喘組 8 33.6±1.3 11.3±0.9 1 436.8±9.6正常干預組 8 25.9±1.4＃ 8.5±0.7＃ 1 395.5±11.5＃肥胖對照組 8 44.3±2.2＊＃ 14.2±1.0＊＃ 1 478.1±7.9＊肥胖哮喘組 8 52.6±3.4＃☆＊▲ 16.2±1.1＃☆▲＊ 1 581.5±9.3＃☆▲＊肥胖干預組 8 34.3±1.2★▲☆ 10.7±0.8★☆▲ 1 415.6±17.0★▲☆

表3 6組大鼠肺組織及ASMC瘦素蛋白的表達（±s）

表3 6組大鼠肺組織及ASMC瘦素蛋白的表達（±s）

＊：P＜0.05，與正常對照組比較；＃：P＜0.05，與正常哮喘組比較；▲：P＜0.05，與正常干預組比較；☆：P＜0.05，與肥胖對照組比較；★；P＜0.05，與肥胖哮喘組比較。

組別 n 肺組織ASMC正常對照組8 0.28±0.06 0.45±0.02正常哮喘組 8 0.47±0.02 0.57±0.07正常干預組 8 0.31±0.03＃ 0.49±0.06＃肥胖對照組 8 0.41±0.05＊ 0.53±0.03＊肥胖哮喘組 8 0.62±0.05＃☆＊▲ 0.72±0.05＃☆＊▲肥胖干預組 8 0.47±0.05★＊▲ 0.56±0.05★＊▲

圖4 Western blot檢測各組大鼠肺組織瘦素（Leptin）蛋白的表達（哮喘組大鼠Leptin蛋白表達增加，阿奇霉素干預后Leptin蛋白表達減少）

圖5 Western blot檢測大鼠ASMC內瘦素（leptin）蛋白的表達

3 討 論

流行病學調查提示肥胖和超重可增加哮喘發生的危險性，《全球哮喘防治創議（GINA）》將肥胖列為支氣管哮喘的獨立危險因素。肥胖對哮喘的影響表現為脂肪組織可以分泌多種促炎因子如Leptin、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-β1和C-反應蛋白，這些炎癥因子都可以加重哮喘炎癥的發生［7］。本研究結果顯示，肥胖哮喘組BALF中白細胞總數及中性粒細胞數較單純哮喘組增高，且HE切片顯示前者炎癥反應明顯加重，氣道及血管周圍大量炎癥細胞浸潤更為明顯，進一步支持肥胖加重了哮喘大鼠的肺部炎癥反應。

肥胖患者脂肪組織分泌的炎癥因子中，瘦素是這些致炎因子中的核心成員，瘦素在肥胖患者體內明顯增加，而且是重要的炎癥調節因子，其生物學效應是通過與相應的瘦素受體結合后發揮的。小鼠和人的肺泡和支氣管上皮細胞均存在瘦素受體［8］。既往對哮喘的研究結果亦發現瘦素導致多種細胞因子、炎癥介質增加以及氣道反應性升高［9］。本研究結果發現，瘦素升高的大鼠肺組織表現出更為嚴重的炎癥細胞浸潤，這表明瘦素在哮喘的發生和發展中起重要作用；血清和BALF以及培養的大鼠ASMC中瘦素濃度均較肥胖對照組顯著升高；而體質量正常哮喘組大鼠較正常對照組也有升高的趨勢。研究表明瘦素能夠促進哮喘氣道炎癥的發展，而氣道炎癥又引起瘦素產生的增加［10］。本研究表明，肥胖哮喘大鼠體內瘦素表達水平明顯增加。

大環內酯類抗生素（macrolide antibiotics，MA）作用廣泛，除具有良好的抗菌活性外，還表現出較強的非特異性抗炎平喘、免疫調節等非抗菌作用［11］。目前，已有MA作用于氣道炎癥性疾病的研究［12］。阿奇霉素是新型大環內酯類抗生素，抗菌譜廣，半衰期長達2～3d，有明顯的抗生素后反應。Beigelman等［13-14］研究發現，阿奇霉素可減輕纖維囊性變小鼠中性粒細胞的浸潤并抑制多種細胞因子的釋放，如白細胞介素-8、腫瘤壞死因子-α等，具有類激素樣抗炎活性。Beigelman等［14］研究發現阿奇霉素可以減輕非感染的哮喘小鼠氣道炎癥反應，抑制了BALF內炎癥細胞因子和趨化因子的表達，如白細胞介素-13、白介素-5等；減輕了黏液細胞的化生。有研究表明瘦素可以調節血小板衍化生長因子誘導的人ASMC的遷移和增殖以及白細胞介素-13誘導的嗜酸性粒細胞趨化因子的產生［15］。阿奇霉素可以抑制ASMC的增殖，還可以松弛ASMC的緊張性［16-17］。本研究也發現，阿奇霉素干預后，肥胖哮喘大鼠BALF和血清中細胞總數和中性粒細胞數減少，瘦素表達與正常對照組比較明顯減低，大鼠氣道炎癥反應減輕。同時本研究發現，阿奇霉素減少了細胞上清液中瘦素的表達。

本研究發現，肥胖哮喘大鼠瘦素表達增加，阿奇霉素干預后瘦素表達減少，從而為肥胖相關的難治性哮喘提供理論依據，但阿奇霉素是否可以用于哮喘等炎癥性疾病的治療，緩解肥胖哮喘的臨床癥狀，有待進一步研究。

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