人參皂苷Rbl對大鼠腦缺血再灌注JAK2／STAT3信號轉導通路的影響＊

余 錄，胡光強，陳碧瓊，涂 華，楊朝鮮

（瀘州醫學院：1.基礎醫學院；2.神經生物研究室，四川瀘州646000）

腦卒中為目前世界上致死率和致殘率排名第2位的疾病［1］，缺血性腦卒中占卒中病例的70%～80%，是腦卒中的主要類型，嚴重威脅人類健康與生命安全。因此，開發安全、有效的治療藥物、尋找確切的治療靶點已是當前迫切需要。人參是中國傳統中藥之精品，人參皂苷（ginsenoside，GR）是人參的主要有效成分，在臨床上尤其是神經科得到廣泛的應用。GR按苷元的不同分多種類型，其中，GRbl含量最為豐富。研究表明，GRbl能通過抗炎、抗氧化、抗凋亡等保護腦缺血再灌注損傷。Janus激酶／信號轉導和轉錄激活因子（Janus kinases／signal transducers and activators of transcription，JAKs／STATs）是細胞因子及氧化應激的一條重要的胞內信號轉導途徑，與腦缺血等中樞神經系統疾病的病理生理過程密切相關［2］。本實驗通過建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注（MCAO／R）模型，探討GRbl對JAK2／STAT 3胞內信號通路的影響，明確其保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 GRbl（純度大于或等于98%，白色粉末，批號：ZL20100705A），由南京澤朗植提技術有限公司提供。磷酸化JAK2多克隆抗體，磷酸化STAT3單克隆抗體（Santa Cruz公司產品）。SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），TNF-α、IL-6ELISA試劑盒（北京環亞泰克生物醫學技術有限公司）；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 實驗動物及分組 雄性SD大鼠，體質量250～300g，購自第三軍醫大學動物飼養中心。隨機分為4組：假手術組、溶媒組、GRbl高劑量組（40mg／kg）、GRbl低劑量組（20mg／kg）。假手術組和溶媒組給予等量的生理鹽水，藥物和溶媒均在再灌時立即腹腔注射。

1.2 方法

1.2.1 MCAO／R模型的建立 大鼠用10%水合氯醛（350 mg／kg）腹腔注射麻醉后，將其仰臥固定于手術臺上，從頸部正中切口，依次小心分離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）及頸內動脈（ICA），結扎并剪斷ECA，在ECA近分叉處用眼科手術剪剪一小口，從ECA往ICA插入制備好的栓線，栓線頭端圓潤，直徑約0.34mm，插入深度為18～20mm，感到有阻力時停止插入，然后將栓線尾端固定于ECA上，逐層縫合肌肉皮膚。缺血2h后，將栓線頭端拉出實現再灌注。術中由紅外燈照射使大鼠體溫維持在37℃。假手術組除不插入線栓外，其余步驟相同。

1.2.2 神經行為學評分 缺血后2h，參照Longa等［3］方法對大鼠進行神經功能缺失評分。0分：無任何神經功能缺損；1分：右前肢不能完全伸展；2分：向左側轉圈；3分：行走或靜止時向左側傾倒；4分：不能自主活動；5分：死亡。在初次評分后滿足1～3分的大鼠納入后繼的實驗組。再灌注后24h，再次對大鼠進行神經行為學評分并進行統計學處理。

1.2.3 TNF-α、IL-6的含量測定 每組8只大鼠，再灌24h后，將大鼠麻醉，剖開胸腔，剪破右心耳，用生理鹽水從左心室灌流至流出液為澄清，取出大腦缺血側-80℃保存，測定前稱重，以1∶10比例加入冰生理鹽水勻漿，3 500r／min離心15min，取出上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-6的含量。

1.2.4 p-JAK2和p-STAT3免疫組織化學的檢測 每組4只大鼠，再灌注24h后，先用冰凍的PBS溶液（pH為7.2～7.4）約200mL快速灌流，再用4%的多聚甲醛溶液灌流。然后迅速剪開顱骨，取出大腦，用10%中性甲醛固定24～48h，從大腦前囟-2.3mm處向后切取厚約3mm的冠狀腦組織，用石蠟包埋，制作厚度約5μm的腦部冠狀切片，用于免疫組織化學染色。免疫組織化學采用SABC法。將石蠟切片脫蠟、復水，3%的H2O2滅活內源性過氧化物酶，然后用微波進行抗原修復、5%BSA液封閉，清洗后加一抗（p-JAK2和p-STAT3），37℃孵育2h，移置于4℃冰箱過夜。加二抗孵育1h，清洗后滴加SABC，37℃孵育1h后，清洗。DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化、氨水返藍、脫水封片。

1.3 統計學處理 免疫組織化學染色后，取缺血側皮層額葉4個不重疊的區域采圖，然后用Image Pro-plus5.0軟件分析免疫組織化學陽性表達的累積光密度值（IOD）并計算每組平均值。所有實驗數據以±s表示，實驗結果采用SPSS16.0軟件進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析的方法進行，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 GRbl對缺血再灌注大鼠神經行為學評分的影響 再灌24 h后，大鼠出現明顯的神經運動功能障礙，其主要表現為Horner綜合征即右側瞳孔縮小、眼瞼下垂、眼裂狹小甚至眼底出血呈紅腫，肢體障礙即提尾時左前肢內收、肩內旋、肌張力明顯降低，爬行時向右側劃圈、追尾，甚至傾倒或不能自行行走。與溶媒組比較，GRbl高劑量組神經行為學評分明顯降低（P＜0.05），GRbl低劑量組評分也有所降低，但差異無統計學意義，見表1。

2.2 GRbl對腦缺血再灌注大鼠腦組織中TNF-α和IL-6的影響 缺血2h再灌注24h后，溶媒組TNF-α、IL-6含量明顯增高。與溶媒組比較，GRbl低劑量組、高劑量組TNF-α含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），IL-6的含量也有所降低，其中，高劑組顯示差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表2。

表1 GRbl對腦缺血再灌注大鼠神經功能評分的影響（±s，n＝12）

表1 GRbl對腦缺血再灌注大鼠神經功能評分的影響（±s，n＝12）

＊：P＜0.05，與溶媒組比較。

組別 神經行為學評分假手術組0.00±0.00溶媒組 2.75±0.96 GRbl低劑量組 2.28±0.51 GRbl高劑量組 1.66±0.65＊

表2 各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6的含量比較（±s，n＝8）

表2 各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6的含量比較（±s，n＝8）

＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，與溶媒組比較。

組別 TNF-α含量（pg／g.pro）IL-6的含量（pg／g.pro）假手術組 75.83±9.20＊＊ 44.67±16.42＊＊溶媒組 142.18±22.43 82.41±21.33 GRbl低劑量組 120.35±17.04＊ 75.58±23.09 GRbl高劑量組 98.29±20.62＊＊ 61.42±16.67＊＊

圖1 p-JAK2和p-STAT3免疫組織化學染色影像學表現（×400）

2.3 GRbl對大鼠腦缺血再灌注損傷后p-JAK2，p-STAT3表達的影響 假手術組未見p-JAK2和p-STAT3免疫陽性細胞的表達，而在溶媒組可見到缺血側大量的深棕色陽性細胞的表達，主要集中在缺血半暗帶，在缺血核心區也有少量表達。GRbl高劑量組、低劑量組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），結果見圖1～2。

圖2 p-JAK2和p-STAT3免疫組織化學染色陽性表達累積光密度值

3 討 論

缺血性卒中損傷涉及的病理機制極為復雜。諸多證據顯示，炎癥事件介導缺血再灌注損傷的病理進程［4］。炎癥級聯反應中，細胞因子、轉錄因子等扮演著重要角色，最終導致神經損傷與功能障礙。JAKs／STATs是細胞因子、氧化應激等介導的重要胞內信號轉導途徑［5］。JAKs蛋白家族包括JAK1、JAK2、JAK3、TYK2，而 STATs 蛋 白 家 族 包 括 STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6。其中JAK2／STAT3與腦缺血密切相關。腦缺血及再灌注損傷導致大量炎性細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6），生長因子以及活性氧的產生和釋放，這些因子與特異受體結合激活JAKs使其酪氨酸殘基磷酸化，識別STATs的SH2區域并轉移至細胞核，調節靶基因的表達，引起白細胞聚集于梗死外周區域，進一步參與遲發性炎性反應，導致神經毒性作用，造成惡性循環。

人參是珍貴的多年生草本植物，具有補氣生血、安神益智、生津止渴之功效。GR是人參、三七等中藥材的主要有效成分，在臨床上尤其是神經科得到廣泛的應用。GR按二元的結構可分為齊墩果酸型、原人參二醇型（如Rb1、R3）和原人參三醇型（Rg1），GRbl是其中含量最豐富的人參皂苷單體之一，其具有廣泛的藥理學活性，作用于中樞神經系統、心血管系統、免疫系統等［6］。研究表明，GRbl能通過抗凋亡等保護腦缺血再灌注損傷［7-8］，而缺血后JAK2／STAT3信號通路異常激活導致神經元凋亡的發生，應用JAK2特異性抑制劑AG490阻斷JAK2和STAT3的磷酸化，而且具有抗細胞凋亡作用［9］。GRbl能抑制缺血再灌注炎性反應［10］，而IL-6、活性氧是選擇性激活JAK2／STAT1、STAT3的細胞因子。有研究發現，GRbl通過JNK／p38MAPK信號途徑減輕神經元tau蛋白的過度磷酸化，而阻斷MAPK的作用后，STAT的轉錄活性明顯降低，表明 MAPK可能激活STAT的轉錄活性［11］。因此，GRbl有可能作用于腦缺血損傷中的JAK2／STAT3信號通路。

本實驗研究發現，大腦缺血2h再灌24h后，大鼠有明顯的神經行為學缺失癥狀，缺血側腦組織可見明顯的水腫以及蒼白色的梗死灶，腦組織中細胞因子TNF-α、IL-6的含量明顯增加。Acalovschi等［12］研究表明，IL-6加重腦缺血損傷，其水平與腦梗死體積相關，是神經功能惡化的預警器。本實驗免疫組織化學染色發現，缺血側皮層p-JAK2和p-STAT3免疫陽性表達提高，而先前文獻報道，缺血再灌注24h，磷酸化STAT3蛋白在缺血半暗帶區達高峰。本實驗在給予人參皂苷處理后，大鼠神經功能障礙減輕，腦組織中炎性細胞因子TNF-α、IL-6含量降低，p-JAK2和p-STAT3的表達也明顯減少，表明GRbl可能通過抑制細胞因子介導的JAK2／STAT3信號途徑保護腦缺血再灌注損傷。

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