絲裂霉素纖維蛋白膠凝膠瘤內注射治療裸鼠肝癌＊

殷香保，鄔林泉，傅華群，羅志強，方 路，章永恩

（南昌大學第二附屬醫(yī)院肝膽外科，南昌330006）

原發(fā)性肝癌（以下簡稱肝癌）是中國一種常見的惡性腫瘤，隨著現(xiàn)代醫(yī)學診斷手段的進步及外科技術水平的提高，可手術切除的肝癌患者數(shù)量日益增多。但到目前為止，肝癌手術患者術后仍有較高的復發(fā)及轉移率。如何最大限度地降低肝癌患者的術后復發(fā)及轉移率仍然是研究者們的不懈追求。纖維蛋白膠（fibrin glue，F(xiàn)G）是一種生物蛋白膠，有研究證明，F(xiàn)G對多種藥物具有較好的緩釋性［1-3］。作者已通過體內外實驗研究證實了FG對絲裂霉素（mitomycin C，MMC）具有良好的緩釋性［4］。在此研究基礎上，作者進一步就絲裂霉素纖維蛋白膠凝膠（mitomycin C mixing with fibrin glue，MMC-FG）對荷肝癌裸鼠的抑瘤效果及毒副作用進行了深入研究，為其在肝癌術中化療的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 MMC（日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社）；FG（廣州倍繡生物技術有限公司，商品名為醫(yī)用生物蛋白膠）；RPMI-1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶（南京生興生物技術有限公司）；EDTA（青島海泰生物技術有限公司）；CO2孵育箱（德國Heraeus公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；人肝癌Bel 7402細胞株（購自中科院上海細胞生物研究所，由南昌大學醫(yī)學動物實驗中心細胞室保種）；三級BALB／c裸鼠（由南昌大學醫(yī)學動物實驗中心提供）。

1.2 MMC-FG的配制 將8mg MMC加入2.5mL FG催化劑溶解液中，搖勻使MMC充分溶解，將所得MMC溶解液加入FG催化劑瓶中，振搖10min使催化劑充分溶解，用FG專用混合注射器的催化劑管吸好；將2.5mL FG主體溶解液加入FG主體瓶中，震搖10min使主體充分溶解，用FG專用混合注射器的主體管吸好；將催化劑管和主體管用混合注射器的人字形針管接好，推注混合注射器使催化劑溶解液與主體溶解液充分混合，即可形成MMC-FG。

1.3 皮下荷肝癌裸鼠模型的建立 將人肝癌Bel 7402細胞株從液氮中復蘇、離心后，轉入培養(yǎng)瓶中，加入適量RPMI-1640培養(yǎng)液及小牛血清，放置在37℃5%CO2孵育箱中培養(yǎng)3～4d，待大部分細胞貼壁生長后，在超凈工作臺上用吸管吸凈培養(yǎng)液，加入適量0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA混合液，待細胞完全游離后，分裝至2個培養(yǎng)瓶中，再加入適量RPMI-1640培養(yǎng)液及小牛血清，放置在CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如此反復傳代至所需細胞數(shù)量，用無菌生理鹽水按1×107個／mL的濃度配成細胞懸液。取一定數(shù)量4～6周齡的三級BALB／c雄性裸鼠（重18～20g），按無菌操作原則，每只裸鼠在右側肩胛部皮下種植細胞懸液0.1mL，繼續(xù)飼養(yǎng)2周，即建立荷肝癌裸鼠模型（腫瘤直徑約1.0cm）。

1.4 MMC-FG抑瘤實驗 取成功建模的皮下荷肝癌裸鼠30只，隨機分成5組，每組6只：A組按無菌操作原則向腫瘤內注射 MMC-FG（相當于含 MMC 0.5mg／kg），B組向腹腔內注射MMC-FG（相當于含 MMC 0.5mg／kg）；C組向腫瘤內注射濃度為1.6mg／mL的 MMC溶液（含 MMC 0.5mg／kg），D組向腹腔內注射FG（5.0mL／kg），E組向腫瘤內注射無菌生理鹽水（0.3mL／kg）。每3天給藥1次，共3次。首次給藥當天開始每2天用游標卡尺測量腫瘤的長徑和垂直徑，用公式：體積＝（長徑×垂直徑2）／2計算腫瘤的體積。至第12天拉頸處死裸鼠，完整剝離腫瘤并稱取腫瘤重量，用公式：瘤重抑制率＝（1-實驗組平均瘤重／對照組平均瘤重）×100%計算瘤重抑制率。同時經眶靜脈采集裸鼠外周血液，檢測白細胞（white blood count，WBC）及血小板（platelet，PLT）。

1.5 荷瘤裸鼠的生存時間 另取成功建模的皮下荷肝癌裸鼠50只，隨機分成5組，每組10只，分組和給藥方法同前。觀察各組裸鼠生長情況，為期40d（從首次給藥當天開始計算），記錄各組裸鼠存活天數(shù)。

2 結 果

2.1 腫瘤生長情況 各組腫瘤生長情況比較見表1。

2.2 腫瘤重量及瘤重抑制率 A組腫瘤重量與B、C組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明瘤內注射 MMC-FG的抑瘤效果優(yōu)于腹腔內注射MMC-FG或瘤內注射MMC溶液。B、C組與D、E組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明腹腔內注射MMC-FG或瘤內注射MMC溶液均有一定的抑瘤作用。首次給藥后第12天各組腫瘤重量和瘤重抑制率見表2。

2.3 荷瘤裸鼠的血象變化 裸鼠給藥后12d外周血液WBC及PLT均不同程度低于給藥前，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。給藥前及給藥后第12天，C組裸鼠外周血液 WBC及PLT檢測低于A組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明瘤內注射MMC-FG對骨髓造血系統(tǒng)的毒副作用顯著小于瘤內注射MMC溶液。A、B組裸鼠 WBC及PLT稍低于D、E組，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

2.4 荷瘤裸鼠的生存時間 給藥期間各組裸鼠均無死亡。實驗第40天，A組仍有2只裸鼠存活，B、C、D、E組分別于實驗第33、36、37、39天全部死亡。A組裸鼠的生存時間長于B、C、D、E組（P＜0.05）。B、C、D組裸鼠的生存時間與E組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 荷瘤裸鼠的生存時間

表1 各組腫瘤生長情況比較（cm3）

表2 首次給藥后第12天各組腫瘤重量和瘤重抑制率

表3 首次給藥前及給藥后第12天各組荷瘤裸鼠血象比較

3 討 論

眾所周知，肝癌惡性程度高，預后差，即使獲得根治性切除，5年內仍有50%患者出現(xiàn)復發(fā)或轉移［5-7］。目前，化學治療仍然是治療肝癌的重要手段。傳統(tǒng)的全身化療方法存在以下缺點：（1）藥物經靜脈注射進入機體后，缺乏對腫瘤組織的選擇性，全身血藥濃度在短時間內遠遠超過中毒濃度，引起相應的毒副作用；（2）常規(guī)化療藥物在機體內半衰期較短，發(fā)揮作用的時間短暫，影響化療效果。因此，多數(shù)學者已不主張對肝癌患者行全身化療。目前，臨床上肝癌患者多采用區(qū)域性化療，如肝動脈栓塞化療（transcatheter hepatic arterial chemoembolization，TACE）、肝動脈和（或）門靜脈置管化療等［8］。這些化療方法使藥物主要集中在肝臟發(fā)揮作用，療效較全身化療有明顯改善。但這些化療方法往往需要經特定的介入性操作才能實現(xiàn)，技術要求較高，且費用昂貴，難于在基層醫(yī)院普及。

FG是一種生物蛋白制劑，臨床上廣泛用于促進創(chuàng)面止血、封閉組織缺損、促進傷口愈合、防止組織粘連等［9-12］。其作用原理是利用參與凝血的有關成分，模擬機體凝血過程的最后階段形成纖維蛋白凝膠。FG形成凝膠后，在機體內具有相對穩(wěn)定性，一般在1周左右逐漸被機體纖溶系統(tǒng)降解吸收。近年來，國內外有研究者利用FG能包裹藥物及在體內分解緩慢的特點，將其作為某些抗腫瘤藥、抗菌藥物、血管內皮細胞生長因子等藥物的緩釋載體，取得了較好的效果［13-15］。本研究結果顯示，裸鼠肝癌瘤內注射MMC-FG的抑瘤效果顯著優(yōu)于單純MMC、FG，且對裸鼠骨髓造血系統(tǒng)的毒副作用顯著小于單純MMC、FG，并能有效延長荷瘤裸鼠的生存時間。其原因可能是FG的包裹作用能使MMC集中在腫瘤內緩慢發(fā)揮抗腫瘤作用，延長了MMC的有效作用時間；同時，F(xiàn)G作為MMC的緩釋載體大大減少了MMC在裸鼠全身血液中的峰濃度，降低了MMC全身毒副作用。當然，采用FG作為包裹載體的方法也有一定的弊病，如可能引起壓力增高，反而促使腫瘤破裂擴散；藥物甚至進入血循環(huán)，加重藥物的毒副作用，實驗時需密切觀察。

MMC是頭狀鏈霉素產生的一種廣譜抗腫瘤抗菌藥物，是肝癌化療常用藥物之一。其作用機制是分子式中的烷化基團與DNA鏈中鳥嘌呤上的N7結合，形成鏈間交叉連結，使DNA解聚，阻止DNA復制。體外實驗證明，MMC對肝癌細胞具有很強的殺傷作用。但它在體內的代謝非常迅速，血漿半衰期只有0.5～1h，在很大程度上影響了其臨床療效；同時，MMC的骨髓抑制作用較重，胃腸道反應及肝、腎功能損害也是化療過程中經常遇到的問題。作者之所以選擇MMC作為被承載的化療藥物，主要原因有：（1）MMC是治療肝癌的經典化療藥物之一，其抗癌效果好；（2）MMC的毒副作用，尤其是骨髓抑制作用較大，易于顯示FG降低其不良反應的優(yōu)勢；（3）MMC的常規(guī)用量小，易于被FG包裹。

［1］Woodruff MA，Rath SN，Susanto E，et al.Sustained release and osteogenic potential of heparan sulfate-doped fi-brin glue scaffolds within a rat cranial model［J］.J Mol Histol，2007，38（3）：425-433.

［2］Spicer PP，Mikos AG.Fibrin glue as a drug delivery system［J］.J Control Release，2010，148（1）：49-55.

［3］Cruysberg LP，Nuijts RM，Gilbert JA，et al.In vitro sustained human transscleral drug delivery of fluorescein-labeled dexamethasone and methotrexate with fibrin sealant［J］.Curr Eye Res，2005，30（5）：653-660.

［4］殷香保，王捷，伍衡，等.絲裂霉素纖維蛋白膠凝膠化療的緩釋特性［J］.中山大學學報：醫(yī)學科學版，2004，25（5）：542-545.

［5］湯釗猷.開展肝癌轉移復發(fā)研究的意義與途徑［J］.中華普通外科雜志，2006，21（6）：761-763.

［6］劉德華，華陽，王少雷，等.肝動脈栓塞化療與灌注化療介入治療結腸癌肝轉移瘤的臨床研究［J］.中國全科醫(yī)學，2006，9（3）：211-212.

［7］叢文銘，董輝，王斌，等.復發(fā)性肝癌臨床病理特點與發(fā)生方式探討［J］.中國實用外科雜志，2009，29（1）：71-73.

［8］羅嘉，吳飛躍，湯明.復發(fā)性小肝癌再次手術和消融栓塞治療的探討［J］.中國普通外科雜志，2011，20（7）：676-679.

［9］Ren J，Wu X，Hong Z，et al.Management of a patient with colocutaneous fistula by autologous platelet-rich fibrin glue［J］.Am Surg，2012，78（1）：86-87.

［10］Yang Y，Sun M，Hou R，et al.Preliminary study of fibrin glue combined with pingyangmycin for the treatment of venous malformations in the oral and maxillofacial region［J］.J Oral Maxillofac Surg，2008，66（16）：2219-2225.

［11］Nahas FX，di Martino M，F(xiàn)erreira LM.Fibrin glue as a substitute for quilting suture in abdominoplasty［J］.Plast Reconstr Surg，2012，129（2）：212-213.

［12］Prieto-Díaz-Chávez E，Medina-Chávez JL，Ramírez-Barba EJ，et al.Reduction of peritoneal adhesion to polypropylene mesh with the application of fibrin glue［J］.Acta Chir Belg，2008，108（4）：433-437.

［13］Stanojkovic Z，Stanojevic G，Stojanovic M，et al.Determination of fibrin glue with antibiotics on collagen production in colon anastomosis［J］.Vojnosanit Pregl，2008，65（6）：681-687.

［14］Lee HH，Haleem AM，Yao V，et al.Release of bioactive adeno-associated virus from fibrin scaffolds：effects of fibrin glue concentrations［J］.Tissue Engineering，2011，28（17）：1969-1978.

［15］Schillinger U，Wexel G，Hacker C，et al.A fibrin glue composition as carrier for nucleic acid vectors［J］.Pharm Res，2008，25（18）：2946-2962.