Netrin-1及VEGF在食管鱗癌組織中的表達水平及其相關性研究

何章彪，曹翠萍，劉衛華，趙 琳，魏抗抗，王翠俠，陳奎生

（1.鄭州大學第一附屬醫院病理科，鄭州450052；2.商丘醫學高等專科學校，河南商丘476100；3.河南省商丘市第一人民醫院 476100）

神經軸突導向因子-1（Netrin-1）是層黏連蛋白相關的分泌蛋白，在調節神經軸突生長、缺氧促進腫瘤血管生成、調節白細胞遷移等方面發揮重要作用。而血管內皮生長因子（VEGF）是目前所知的作用最強的促血管形成因子之一，在腫瘤血管形成中起重要作用［1］。有關食管鱗癌組織中Netrin-1、VEGF蛋白及mRNA表達及其意義尚未見文獻報道。作者采用免疫組織化學與原位雜交方法觀察食管鱗癌組織中Netrin-1、VEGF的蛋白及mRNA表達，從而探討其與食管癌發生、發展及浸潤轉移的關系以及VEGF和Netrin-1的相關性。

1 資料與方法

1.1 實驗標本 組織標本系河南省商丘市第一人民醫院2011年3月至2012年3月食管癌新鮮手術切除標本，共50例，病理檢查證實均為鱗癌，并取相應的癌旁不典型增生標本19例及正常食管黏膜標本20例。食管鱗癌患者中，男33例，女17例，年齡40～74歲。50例食管標本按有無淋巴結轉移分為：轉移組14例和無轉移組36例。術前均未接受放化療。

1.2 實驗試劑 Netrin-1、VEGF免疫組織化學SP試劑盒及Netrin-1、VEGF原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；VEGF鼠抗人單克隆抗體、Netrin-1兔抗人抗體購買于北京中杉試劑公司；胃蛋白酶、預雜交液及核固紅均購自武漢博士德生物工程有限公司；SP-AP（streptavidin A1-kaline phosphatase）及BCIP／NBT購自美國Promega公司，Netrin-1探針（5′-GGA AGT TCA CGG TGA ACA T-3′），VEGF探針（5′-GTC ATG GAA TCC ATC TGT TGA GT-3′）由北京奧科生物技術有限責任公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標本處理 食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織經40g／L的多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組織化學及原位雜交檢測。

1.3.2 免疫組織化學 免疫組織化學SP法染色步驟按照試劑盒及一抗（濃度為1∶100）說明書要求進行，同時用購自武漢博士德公司（Netrin-1）及北京中杉試劑公司（VEGF）的陽性對照片進行陽性對照及用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3.3 原位雜交 參照原位雜交試劑盒說明書操作，以不含探針的預雜交液進行雜交及雜交前用RNase處理樣本作陰性對照。

1.3.4 免疫組織化學及原位雜交結果判定 在顯微鏡下觀察并計數，每張切片觀察10個視野（×200），并取均數。按陽性細胞數所占的百分比分為：陰性：陽性細胞數小于5%；弱陽性：陽性細胞數占5%～25%；陽性：陽性細胞數占25%～50%；強陽性：陽性細胞數大于50%。為便于統計，將弱陽性和陰性歸為陰性，陽性和強陽性歸為陽性［2］。

1.4 統計學處理 應用SPSS13.0軟件數據進行統計分析，行χ2檢驗及列聯表的關聯性分析，檢驗標準α＝0.05。

2 結 果

2.1 免疫組織化學與原位雜交結果 Netrin-1蛋白陽性信號位于正常食管鱗狀上皮細胞、食管癌細胞或癌旁不典型增生細胞胞膜，在細胞與細胞的接觸面的表達更為清晰，呈棕黃色顆粒（圖1A）。Netrin-1mRNA陽性信號位于正常食管鱗狀上皮細胞、食管癌癌細胞或癌旁不典型增生細胞胞質中，呈藍紫色顆粒（圖1B）；VEGF蛋白陽性表達主要定位于細胞胞質（圖1C）。VEGF mRNA陽性信號位于正常食管鱗狀上皮細胞、食管癌癌細胞或癌旁不典型增生細胞胞質中，呈藍紫色顆粒（圖1D）。

2.2 食管鱗癌組織中Netrin-1、VEGF的蛋白及mRNA表達見表1。食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織與正常食管黏膜組織中Netrin-1、VEGF蛋白及mRNA表達，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 食管鱗癌組織中VEGF、Netrin-1蛋白及mRNA的影像學表現（SP，×400）

表1 食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織及其正常組織中Netrin-1、VEGF蛋白及mRNA表達比較［n（%）］

表2 VEGF及mRNA蛋白的表達與淋巴結轉移的關系

表3 Netrin-1及mRNA蛋白的表達與淋巴結轉移的關系

2.3 Netrin-1及VEGF蛋白表達與食管癌轉移的關系 見表2～3。有淋巴結轉移的食管鱗癌組織中Netrin-1蛋白及mRNA、VEGF蛋白及mRNA表達均高于無淋巴結轉移的相應組織（P＜0.05）。

2.4 VEGF和Netrin-1的相關性 在VEGF蛋白表達陽性病例中，Netrin-1蛋白表達陽性率為91.18%（31／34），VEGF蛋白表達陰性病例中Netrin-1蛋白表達陽性12.50%（2／16），經統計學分析，結果顯示列聯系數（contingency coefficient）r＝0.941 3，P＜0.01，提示兩種蛋白在食管癌組織中的表達成正相關性。在VEGF mRNA表達陽性病例中，Netrin-1mRNA表達陽性率為89.29%（25／28），VEGF mRNA表達陰性病例中 Netrin-1mRNA表達陽性率為9.09%（2／22），經統計學分析，結果顯示列聯系數r＝0.584 7，P＜0.01，提示兩種 mRNA在食管癌組織中的表達成正相關性。

3 討 論

Netrin家族是一類與層黏連蛋白相關的可分泌蛋白，也是重要的神經突起導向因子，在結構上高度保守［3］。Netrin-1是Netrin基因家族中研究較多的重要成員之一。近年研究結果顯示，Netrin-1可通過調節腫瘤血管生成調節腫瘤的形態發生和發展、轉移［4］。2004年，Park等［5］在 PNAS上率先報道 Netrin-1是一血管生成因子，既能促進內皮細胞增生、遷移和黏附，增生效應類似于經典的內皮細胞促進因子——血管內皮生長因子；又能促平滑肌細胞增生，效應等同于經典的平滑肌細胞促進因子——血小板源性生長因子。幾乎與此同時，Fitamant等［6］報道，去除Netrin-l基因表達，會導致內皮端細胞偽足迷亂、過度分支和方向異常，提示Netrin-l具有調控血管方向和形態發生功能。

Netrin-1與惡性腫瘤侵襲性的關系也受到重視。Otrock等［7］基于Netrin-l轉基因小鼠的研究證實，Netrin-l在轉基因小鼠的結腸中高表達，而其受體DCC和UNC5H在所有腸上皮細胞中均有表達，與之相應的表型是結腸增生和腺瘤發生頻率增高，提示Netrin-1可能作為原癌基因在結腸癌的早期發揮重要作用。Mehlen等［8］發現Netrin-1與乳腺癌細胞的存活及轉移關系密切，認為Netrin-1有利于轉移的乳腺癌細胞存活，但不足以導致形成癌細胞轉移灶；Netrin-l的表達量有利于判斷乳腺癌的轉移性，如乳腺癌組織中Netrin-l高表達，則轉移性強。近來有研究表明，在92例非小細胞肺癌中，Netrin-1高表達的有43例（占47%）；且通過增強或減弱Netrin-1表達對腫瘤的影響研究可能存在的聯系，結果提示Netrin-1有可能成為治療肺癌的新靶點［9］。本研究顯示Netrin-1表達在淋巴轉移的患者中陽性表達明顯升高，表明Netrin-l在食管癌中的表達上調可能在食管癌癌細胞侵襲轉移過程中發揮重要作用。實驗結果顯示Netrin-1在食管癌侵襲轉移過程中扮演重要角色，可能被作為腫瘤基因治療的新靶點進行研究。

VEGF是目前已知作用最強的促血管形成因子之一，也是腫瘤細胞分泌的血管形成因子中最重要的一種，新血管形成是保證腫瘤生長和轉移的組織學基礎，受多種促血管因子和抗血管生成因子的雙重調節。據報道，食管鱗癌陽性率為23.9%～93.3%，本研究為68.0%。VEGF主要表達于癌細胞，具有明顯的異質性，強陽性表達的細胞多位于浸潤前緣，在血管內皮不表達或極少量表達，與 Mbius等［10］的報道相似。推測VEGF主要以旁分泌途徑作用于血管內皮細胞。VEGF是高度特異的血管內皮細胞有絲分裂原［11］，是腫瘤新生血管生成的重要調控因子［12］，不僅參與腫瘤血管生成、增殖，還直接與腫瘤浸潤轉移有關，且其表達水平與腫瘤的惡性程度有關［13］。VEGF與食管鱗狀細胞癌的浸潤程度、淋巴結轉移呈正相關。因此，可以作為判定食管癌生物學行為的檢測及預后指標［14］。本研究顯示，VEGF在食管癌中的表達與癌旁非典型增生組織及正常食管黏膜組織比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示VEGF可誘導食管癌腫瘤血管形成，提高其通透性，促使腫瘤細胞浸潤轉移、惡性程度增加。

VEGF是目前已知作用最強的促血管形成因子之一，而Netrin-1可通過調節腫瘤血管生成調節腫瘤的形態發生和發展、轉移［15］。因此，Netrin-1和VEGF基因蛋白之間可能有協同作用。實驗結果顯示Netrin-1和VEGF基因蛋白在正常食管黏膜組織中基本不表達，而在食管癌組織中有不同程度的陽性表達，食管癌中VEGF及Netrin-1的表達存在正相關性。它們以不同的機制促進了食管癌的發生、發展、侵襲和轉移。對食管癌患者進行Netrin-1和VEGF的聯合檢測，有可能作為食管癌的診斷和評估其預后的重要分子生物學指標。判斷食管癌的侵襲和轉移能力，為術后高危患者制訂合理的治療方案及防止腫瘤的復發和轉移提供可靠的依據。但是，在體內食管癌侵襲、轉移過程中，Netrin-1基因的作用及其分子機制，還有待進一步研究。

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