脂聯素及其受體在LIPC抗MIRI大鼠心肌細胞凋亡中的作用＊

高建芝，趙林靜，張婧君，騰清蕾△

（1.新鄉醫學院基礎醫學院法醫綜合實驗室，河南新鄉453003；2.新鄉醫學院基礎醫學院微生物學教研室，河南新鄉453003；3.新鄉醫學院第三附屬醫院麻醉科，河南新鄉453003）

近年國內外學者研究發現，心肌缺血-再灌注（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）引起的心肌損傷與心肌細胞的信號轉導通路密切相關。目前臨床上許多藥物及機械處理大都是通過這些細胞信號轉導通路來實現對心肌的保護作用。其中脂聯素／脂聯素受體1（adiponectin／adiponectin receptor-1，ADP／ADPR1）信號轉導通路是近期的研究熱點，在促進細胞的生存中發揮著極其重要的作用［1-4］。近年來，通過對ADP的研究證實了其在心血管領域的生物學效應，包括調節促增殖反應、抗凋亡作用和抗感染作用等［5-9］。盡管ADP在MIRI中有抗損傷和抗凋亡的作用，但其是否通過ADP／ADPR1信號通路對損傷的心肌細胞起保護作用及其機制仍不清楚。本研究旨在探討在體內狀態下，ADP／ADPR1信號通路是否在抗MIRI大鼠心肌細胞凋亡中發揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 本研究采用SD雄性大鼠30只，體質量220～280g，由河南省實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 DNA標記、總RNA提取試劑盒和逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，原位末端缺口標記細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理 實驗分為3組，每組10只。MIRI組：結扎冠狀動脈左前降支30min再灌注120min；假手術sham組：手術過程與MIRI組相似，僅穿線不結扎冠狀動脈左前降支；肢體缺血預適應（limb ischemic preconditioning，LIPC）組：持續阻斷股動脈標志5min后，持續再灌注5min，如此反復3次，連續預適應3d，第4d進行MIRI實驗，手術操作同MIRI模型。各組實驗結束時，迅速摘取每組大鼠心臟缺血區中心部分的心肌組織作為留存的心肌組織標本并放置在無菌無熱源凍存管內后置入液氮罐中，隨后放入-80℃冰箱中。

1.2.2 RT-PCR檢測 采用Trizol一步法提取各組大鼠心肌總RNA進行逆轉錄。β-actin：上游引物：5′-CAG TAA CAG TCC GCC TAG AA-3′，下 游引物：5′-GAT TAC TGC TCT GGC TCC TA-3′379bp；ADP：上游引物：5′-CTT CCA GAA ACG TGA TCC GAA-3′238bp，下游引物5′-AGT CCT TGC AGG AAG AGT GAC C-3′；ADPR1：上游引物5′-GGT GAA GGT CGG AGT CAA CGG-3′215bp，下游引物5′-GGT CAT GAG TCC TTC CAC GAT-3′。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電離觀察，成像。

1.2.3 原位末端缺口標記（TUNEL）法檢測心肌細胞凋亡 具體操作步驟完全按照試劑盒說明書進行，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替反應液做陰性對照。凋亡的細胞核呈棕黑色或棕色。每只大鼠觀察4張切片，每張切片計數5個視野（×400），計算每個視野內凋亡陽性細胞核數占細胞總數百分比，取其平均值為心肌細胞凋亡指數。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0軟件處理數據，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組ADP和ADPR1mRNA檢測結果 RT-PCR法測ADP和ADPR1的mRNA表達結果顯示，以β-actin為內參，用ADP和ADPR1與β-actin比值代表目的條帶強度的相對值，與sham組 ADP（0.74±0.08）和 ADPR1（0.72±0.041）相比，MIRI組 ADP（0.53±0.07）和 ADPR1（0.52±0.016）的mRNA表達明顯減少（P＜0.05）；與 MIRI組相比，LIPC組上調ADP（0.72±0.21）和ADPR1（0.80±0.023）的 mRNA表達（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織ADP、ADPR1mRNA的表達情況

2.2 TUNEL法檢測各組心肌細胞凋亡的情況 棕色核為凋亡細胞核，計算凋亡指數（AI），結果顯示sham組大鼠凋亡心肌細胞較少見；MIRI組大鼠凋亡陽性細胞數目（18.68±2.81）比sham組（2.01±0.44）明顯增加（P＜0.05）；與 MIRI組相比，LIPC組的心肌細胞 AI（8.17±1.93）明顯減少（P＜0.05），提示LIPC可以減輕MIRI損傷誘導的心肌細胞凋亡，見圖2。

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況的比較（×400）

3 討 論

研究表明ADP／ADPR1信號通路參與了抑制炎性反應和抑制細胞凋亡的過程［10-11］。近年又發現 MIRI損傷后，ADP也參與了損傷心肌的修復，增加ADP水平或增加心肌對ADP的敏感性可減輕心肌梗死后左心室的功能障礙［12］。

血清ADP通過血液循環到達心肌組織與ADPR1結合發揮心肌保護作用。至今共發現3種ADP受體：ADPR1、ADPR2和T鈣粘蛋白，其分布呈高度組織特異性［13］，其中AD-PR1主要分布在心肌。心肌局部ADP統與心肌細胞能量代謝及功能狀態密切相關［14］。也有研究表明，血清ADP與ADPR1結合可發揮心肌保護作用，如可以減輕MIRI損傷、心肌重塑和左心室收縮功能障礙［15］。

近年來通過離體結扎冠狀動脈前降支造成MIRI模型發現，與野生鼠比較，ADP基因敲除鼠的心臟明顯擴大，心肌細胞凋亡數量和心肌纖維化程度明顯增加，而新生毛細血管密度顯著降低［16］。

肢體LIPC可以合成釋放內源性保護物質，然后經復雜的細胞信號轉導途徑發揮MIRI保護作用。心肌細胞ADP／ADPR1途徑的激活就是此保護作用的具體機制之一，可以引起下游一系列靶蛋白的磷酸化，抑制線粒體通透性轉換孔（mPTP）的開放，最終減少心肌細胞凋亡［17］。

本實驗結果顯示，MIRI大鼠心肌ADPR1表達水平下降，限制了ADP發揮其生物學作用，尤其是對MIRI大鼠心肌細胞凋亡的過程起促進作用。MIRI大鼠ADP和ADPR1mRNA的表達明顯低于sham組，LIPC組較MIRI組心肌組織ADP和ADPR1mRNA的表達明顯增高，以上各組心肌組織ADP mRNA的表達水平與ADPR1mRNA表達水平呈正相關，提示ADP與其受體的結合對心肌組織的保護作用以及LIPC的心臟保護效應是通過上調ADP的水平實現的。

在本實驗中LIPC明顯抑制了再灌注損傷后的細胞凋亡，且LIPC組中ADP和ADPR1mRNA的表達高于MIRI組，提示LIPC具有抑制細胞凋亡的作用并且可能通過ADP／ADPR1信號通路來抑制心肌細胞凋亡。

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