纖維母細胞生長因子10基因在角膜混濁小鼠中的克隆測序與表達研究＊

吳劉成，張柳柳，李 瑤，王勝潔，季 韌，倪堯尉，邵義祥△

（1.南通大學比較醫學研究所，江蘇南通226001；2.南通大學醫學院，江蘇南通226001）

在哺乳動物正常發育過程中，眼瞼生長覆蓋眼睛、融合，而后重新開放。小鼠在正常發育過程中，胚胎期約11d開始出現原始的眼瞼即單層細胞上皮，隨著眼瞼不斷生長發育覆蓋了角膜，約第16.5d眼瞼上緣和下緣融合，完成胚胎期眼瞼閉合，出生后約14d眼瞼重新開放［1-2］。B6-Co（C57BL／6-corneal opacity）小鼠是通過乙基亞硝基脲（ENU）誘變技術獲得并建立的出生時眼瞼開放（EOB）突變系小鼠，出生后角膜逐漸混濁，角膜混濁發生率約為43.1%［3］，突變基因定位于13號染色體上60cM附近［4］。纖維細胞生長因子10（fibroblast growth factor 10，Fgf10）基因突變小鼠也表現為出生時眼瞼開放［5］，并且該基因位于突變基因定位區間。因此，本實驗對該基因進行克隆測序分析，并利用實時熒光聚合酶鏈式反應（PCR）技術檢測Fgf10基因的表達，探討Fgf10基因與B6-Co小鼠EOB表型的關聯，為研究人類遺傳性眼瞼缺陷形成機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗所用B6和B6-Co小鼠由南通大學實驗動物中心提供，小鼠飼養在清潔級屏障動物房內，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2008-0010，使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0030。用B6與B6-Co小鼠交配，次日清晨檢栓，妊娠16.5d，麻醉取胚胎。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol、瓊脂糖為加拿大BBI公司生產；逆轉錄試劑盒（RT）、Taq DNA Polymerase為加拿大Fermentas公司生產；引物合成、UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒為生工生物（上海）股份有限公司生產；T載體試劑盒為美國Promega公司生產；TOP10感受態細胞、質粒小抽試劑盒為南京天根公司生產；EcoRⅠ為大連寶生物工程有限公司生產；熒光染料試劑盒為美國Biotium公司生產。超凈工作臺為蘇凈集團安泰公司生產；Centifuge 5417R冷凍離心機、Eppendorf AG 22331Hamburg PCR儀為德國Eppendorf公司生產；DYY-6B型穩壓穩流電泳儀為北京市六一儀器廠生產；凝膠成像系統為江蘇省捷達科技發展有限公司生產；Step One Real-Time PCR System為美國ABI公司生產。

1.3 方法

1.3.1 引物設計 在Gene Bank中查找并下載Fgf10mRNA序列，以mRNA為模板設計部分引物，引物之間有重疊區域，Fgf10-a正向引物：5′-CAC CGT CCT GTC ATC TGT TT-3′，反向引物：5-TTC TTC TAT GTT TGG ATC GTC A-3′；Fgf10-3正向引物：5′-ATG GAA TCA AGT ATT ATC ACC-3′，反向引物：5′-AGT GTT TGC CAA GGT TTT-3′；Fgf10-c正向引物：5′-GCA CAA CCA AAG GAG C-3′，反向引物：5′-GAT CTA CAG AGC GAG GG-3′；Fgf10-d正向引物：5′-GCA CAA CCA AAG GAG C-3′，反 向引物：5′-GAT CTA CAG AGC GAG GG-3′；Fgf10-e正向引物：5′-GCA CAA CCA AAG GAG C-3′，反向引物：5′-GAT CTA CAG AGC GAG GG-3′。設計實時熒光PCR引物，引物至少跨2個外顯子，Fgf10正向引物：5′-TCC GCT GGA GAA GGC TGT-3′，反向引物：5′-CAA CTC CGA TTT CCA CTG ATG T-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，正向引物：5′-GGA GCG AGA CCC CAC TAA C-3′，反向引物：5′-GGC GGA GAT GAT GAC CCT-3′。

1.3.2 組織總RNA的提取和逆轉錄 剪取胚胎16.5dB6和B6-Co小鼠皮膚組織，放入勻漿器中，置于冰上，加入1mL TRizol，充分勻漿，按照試劑盒說明操作，最后用焦碳酸二乙（DEPC）處理水溶解獲得RNA，核酸定量儀測定RNA濃度；按照RT試劑盒說明將RNA逆轉錄合成cDNA。

1.3.3 基因測序 PCR反應體系，10×PCR緩沖液 （buffer，含 Mg2＋）5.0μL，dNTP（10mmol／L）1μL，上游引物（50 μmol／L）0.5μL，下游引物（50μmol／L）0.5μL，模板cDNA 2.5ng，Taq DNA polymease（5U／μL）0.25μL，補滅菌去離子水至50μL。擴增條件，94℃5min；94℃1min，63℃30s；72℃30s，35個循環，72℃5min，根據引物熔解溫度（Tm）值和擴增長度調整退火溫度、變性時間及延伸時間。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，成像保存。PCR產物的純化（膠回收），方法參照膠回收試劑盒進行。基因測序、回收產物與相應引物寄送上海生工生物股份有限公司測序。

1.3.4 基因的克隆測序 將發現突變的純化PCR產物與T載體連接，2×buffer 5μL，目的DNA 1～3μL，T載體1μL，T4DNA Ligase 1μL，補滅菌去離子水至10μL，4℃ 過夜。取5μL鏈接產物和50～100μL感受態細胞加入預冷的離心管中；冰浴5min；42℃熱休克90s；冰浴30min；加入200μL Luria-Bertani（LB）培養液，37℃，250r／min，振蕩培養45min；取120～200μL菌液涂于1.5%瓊脂LB平板（添加氨芐青霉素、β-半乳糖苷酶和異丙基硫代半乳糖苷）；37℃培養過夜；挑取白斑，擴培搖菌12～14h；提取質粒DNA分子；電泳檢測；EcoRⅠ酶切釋放目的片段，電泳檢測，寄送上海生工生物股份有限公司測序。

1.3.5 實時熒光PCR 以GAPDH基因為內參，每個樣品設置3個重復，反應體系為熒光染料預混液10μL，正、反引物各1μL，cDNA 1μL，補滅菌去離子水至20μL。反應條件，95℃4min；95℃20s，60℃20s，72℃30s并讀取熒光值，45次循環，循環后設置55～90℃每隔0.3℃讀熒光值生成熔解曲線。所有設定保存后運行程序。反應完成后，用相對定量分析方法分析各樣品表達量。

1.4 統計學處理 PCR數據采用Stata7.0軟件分析，計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Fgf10基因測序及克隆測序結果 分別以表1中前5對引物對角膜混濁小鼠的基因進行擴增，從左向右依次電泳，得到大小不同的5個基因片段（圖1A）。對以上5個片段割膠回收后分別進行測序，發現第4個片段基因有突變（圖1B）。將第4個基因片段用T載體連接，對該基因片段進行克隆。通過藍白斑篩選出重組質粒、質粒的鑒定，從上到下分別是開環質粒，環狀質粒和超螺旋質粒，膠回收中間條帶的環狀條帶（圖1C）。重組質粒的EcoRⅠ酶切片段電泳圖。限制性內切酶作用于重組質粒后，將環狀重組質粒切成2個大小不同的片段，膠回收目的基因（圖1D）。分離出目的基因，再對目的基因測序分析，并通過數據庫比對發現在該基因第3外顯子1 914bp和1 915bp之間插入堿基A（圖1E）。

圖1 Fgf10基因克隆測序流程圖

圖2 Fgf10基因擴增曲線和熔解曲線圖

圖3 實時熒光PCR檢測Fgf10基因在B6-Co小鼠中的表達

2.2 熒光定量PCR分析結果 由圖2可知，GAPDH、Fgf10 2個基因的擴增曲線均接近“S”型曲線，基因擴增效率良好；熔解曲線分析發現2個基因的PCR產物均呈較為銳利的單峰，無雜峰。Fgf10基因mRNA表達水平在B6-Co小鼠中明顯低于B6小鼠，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

3 討 論

眼瞼是眼的門戶，能夠保護眼球避免受外傷與強烈光線刺激，協助瞳孔調節進入眼內光線，起到維持眼位及眼功能的作用；眼瞼還與其他眼附屬器一起共同發揮功能作用，保護角膜免受微生物感染。因此，眼瞼發育缺陷將使眼的門戶受損，調節和保護功能受限或缺失，導致各種眼部疾病［6-7］。人類遺傳性眼瞼缺陷并伴有其他眼部疾病是一種遺傳性／先天性疾病，將有可能進一步造成嚴重的眼科疾病，如角膜炎、角膜感染、角膜混濁，重則致盲，現在臨床多采用手術植皮的方法進行眼瞼的修復，沒有對應的動物模型可供研究。如何做到早期的診斷、預防和治療，必須首先建立起研究技術平臺，進行基礎理論和實驗技術的研究，建立可利用的動物模型深入進行研究是最佳途徑。

小鼠胚胎眼瞼閉合，是一個包括細胞增殖和遷移，細胞形態，牽涉許多生理和病理過程的動態發育過程［8］。絕大多數的哺乳動物的眼瞼發育都要經歷由融合至再分離的過程，并且這個過程能以相對恒定的程序發生。眼瞼覆蓋在眼球的前方，起保護眼球的作用，新生小鼠正常情況下眼瞼閉合，若眼瞼不能閉合，可能由于新生鼠抵抗力低，受外界病原體感染及異物刺激，引起角膜感染及角膜混濁。B6-Co小鼠眼瞼發育缺陷導致角膜發育異常和先天性眼表疾病，該小鼠角膜混濁的病理過程呈典型的炎性反應，與人類角膜炎的病理變化過程相似［9］，值得進一步研究開發其價值。

Fgf10缺失小鼠在出生時表現出眼瞼開放并伴有多器官發育缺陷［10］。Jin等［11］已經證實Fgf10通過調節表皮生長因子受體（EGFR）信號通路來促進細胞增殖和遷移以促進眼瞼的發育。還有研究表明，Fgf10的功能可能是調節細胞骨架的活性和基因轉錄，在小鼠眼瞼發育中，可能與Wnt信號通路調節有關［12］。通過分離和培養野生型和Fgf10缺陷型胚胎眼瞼的角質形成細胞，行體外劃痕實驗，證明小鼠眼瞼上皮細胞的增殖、遷移能力受到嚴重阻礙，從而導致新生小鼠眼瞼上下緣周皮的完整性存在缺陷，Fgf10信號中斷也使得激活素βB和Tgfa下調，且延遲了聲音刺猬（Shh）蛋白的表達［13］。

有研究表明，基因的編碼區或非編碼區發生點突變后，可以使機體產生某種疾病［14-15］。本實驗對該基因進行了PCR擴增，通過克隆測序發現在Fgf10基因第3外顯子1 914bp和1 915bp之間插入堿基A（圖1），位于3′末端非編碼區。為進一步了解該突變基因在B6-Co小鼠中的作用，采用實時熒光PCR技術檢測Fgf10基因的表達變化，結果表明該基因在B6-Co小鼠胚胎E 16.5d的表達明顯下調（P＜0.05）（圖3），提示該突變位點可能影響了其基因的表達，或直接影響了功能蛋白質的翻譯與剪接，是否B6-Co小鼠中存在其他突變基因而影響了Fgf10基因的表達調控也值得深入探討。作用于基因表達調控的因素很多，其具體機制需進一步深入研究，從而為人類眼科類疾病的診斷、治療及預防提供參考依據。

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