二苯乙烯苷對小鼠肝細(xì)胞色素P450的影響＊

張 鋒，劉 航，王艷英，聶 晶，陸遠(yuǎn)富，石京山

（遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室暨貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室，貴州遵義563099）

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）屬于藥物代謝的第一相酶，主要存在于肝臟微粒體中，在藥物生物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮非常重要的作用。大量的研究證實CYP被激活或被抑制是引起藥物相互作用和導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)增加或療效降低的重要原因［1］。因此，在臨床聯(lián)合用藥時，研究藥物對CYP的影響，對于評估其他藥物在體內(nèi)的血藥濃度水平可能的改變方向具有指導(dǎo)意義。二苯乙烯苷（tetrahydroxystilbene glucoside，TSG）是何首烏的主要藥效成分之一［2］。研究發(fā)現(xiàn)，TSG具有抗氧化、抗衰老、增強免疫力、調(diào)節(jié)血脂、抗動脈粥樣硬化、提高學(xué)習(xí)記憶力、抗炎、抗腫瘤及保肝等作用［3］。鑒于TSG的藥理作用廣泛，與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用潛在機會較多，本研究擬采用實時逆轉(zhuǎn)錄PCR（real time reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）探討TSG對小鼠肝組織微粒體CYP的影響，以期為臨床合理用藥提供基礎(chǔ)藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量20～24g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心，許可證號為SCXK-（軍）2012-0410。

1.2 儀器與試劑 TSG（C20H22O9相對分子質(zhì)量406，純度大于98%，批號：110844200607）購自中國藥品生物制品檢定所；RNA提取試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；所有引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄儀購自德國Eppendorf公司；RT-PCR擴增儀購自美國BIO-RAD公司；紫外分光光度計（型號TU1810）購自北京譜析儀器公司；電子分析天平購自北京賽多利斯電子有限公司；高速冷凍離心機購自德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.2 實驗分組和給藥 昆明種雄性小鼠45只分為3組：空白組、TSG低劑量組（10mg／kg）、TSG高劑量組（40mg／kg），每組15只；后兩組組每天灌胃給予TSG溶液，空白組灌胃給予藥物等體積的生理鹽水。

1.3.2 RT-PCR檢測 藥物灌胃3、5、7d后分別用10% 水合氯醛麻醉小鼠，固定，剪開腹腔取肝臟于總RNA提取試劑（Trizol）液中勻漿，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，首先提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成第1鏈互補cDNA，通過特異性引物對小鼠肝組織中的CYP1A2、CYP2B10、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A11、CYP3A25、CYP4A14和內(nèi)參基因β-actin進行擴增［4］，基因引物序列為：β-actin上游：3′-TCG TAC CAC TGG CAT TGT GA-5′，下游：3′-TCC TGC TTG CTG ATC CAC AT-5′；CYP1A2上游：GCC TGA GAT ACA GAG GAA GATCCA-5′，下游：3′-GGC ACA TAA CAG GTG TTT GTA GAC T-5′；CYP2B10上游：3′-AAG GAG AAG TCC AAC CAG CA-5′，下 游：3′-CTC TGC AAC ATG GGG GTA CT-5′；CYP2E1上游：3′-GGC ACC ATG TCT GCC CTC GG-5′，下游：3′-CCT CCA CAC ACT CAT GAG CG-5′；CYP3A4上游：3′-AAC TTT GGC ATT GAA CAG CA-5′，下 游：3′-GGA TGC AGG GAT GAT GAC TA-5′；CYP3A11上游：3′-CTC AAT GGT GTG TAT ATC CCC-5′，下游：3′-CCG ATG TTC TAA TGC C-5′；CYP3A25：上游：3′-AGT ACT GGC CAG AGC CTC AA-5′，下游：3′-TCG TTC TCC TTG CTG AAC CT-5′；CYP4A14上游：3′-CGA CTC GAT CCA GAA ACT AC-5′，下游：3′-ACA GGA CAC ATT GCA GAG AG-5′。

表1 TSG對小鼠肝臟CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4和CYP4A14mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝5）

表1 TSG對小鼠肝臟CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4和CYP4A14mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝5）

a：P＜0.05，與空白組比較；b：P＜0.05，與 TSG高劑量組作用7d時比較。

3d 5d 7d CYP1A2 空白組基因 組別160.49±37.47 128.33±17.03 137.07±13.40 TSG低劑量組 94.85±28.08a 77.52±36.03 86.45±29.35 TSG高劑量組 108.20±17.59a 59.63±13.60a 87.60±19.41a CYP2E1 空白組 85.58±25.41 72.41±29.07 86.95±48.30 TSG低劑量組 86.06±28.90 78.46±17.15 139.47±44.96 TSG高劑量組 140.37±22.54ab 190.62±34.63ab 284.05±72.83a CYP3A4 空白組 91.01±14.14 134.23±35.98 174.51±44.49 TSG低劑量組 140.59±38.17 100.69±41.58 187.18±70.91 TSG高劑量組 46.49±13.75a 44.53±12.71a 29.62±11.88a CYP4A14 空白組 169.34±42.28 116.48±39.03 164.49±17.11 TSG低劑量組 119.96±18.04 52.40±30.29 150.06±29.27 TSG高劑量組 109.87±38.18 78.75±32.21 87.31±26.61a

表2 TSG對小鼠肝臟CYP2B10、CYP3A11和CYP3A25mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝5）

表2 TSG對小鼠肝臟CYP2B10、CYP3A11和CYP3A25mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝5）

3d 5d 7d CYP2B10 空白組基因 組別57.73±33.28 132.36±56.41 207.31±46.03 TSG低劑量組 78.33±31.15 136.16±49.03 170.29±29.19 TSG高劑量組 66.43±9.18 89.29±38.09 156.03±28.24 CYP3A11 空白組 187.31±49.78 122.65±27.53 123.22±46.43 TSG低劑量組 171.22±39.64 77.06±29.45 120.16±34.88 TSG高劑量組 115.96±53.13 109.68±18.98 202.31±47.21 CYP3A25 空白組 177.90±55.34 73.33±36.24 135.59±41.24 TSG低劑量組 134.54±37.75 40.42±34.01 166.22±63.21 TSG高劑量組145.08±35.53 71.52±41.25 190.56±68.14

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TSG 對 小 鼠 肝 臟 CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4 和CYP4A14表達(dá)的影響 與空白組比較，TSG高劑量作用3、5、7d后均能夠抑制CYP1A2mRNA的表達(dá)，而TSG低劑量作用3d能夠抑制CYP1A2mRNA的表達(dá)；TSG高劑量作用3、5、7d后呈時間依賴性的增加CYP2E1mRNA的表達(dá)，TSG低劑量對CYP2E1mRNA的表達(dá)無顯著影響；TSG高劑量作用3、5、7d后均能夠顯著抑制CYP3A4mRNA的表達(dá)，TSG低劑量對CYP3A4mRNA的表達(dá)未見明顯作用；TSG低劑量和高劑量分別作用3、5d后對CYP4A14mRNA的表達(dá)無顯著影響，而TSG高劑量作用7d后能夠顯著抑制CYP4A14 mRNA的表達(dá)，見表1。

2.2 TSG對小鼠肝臟CYP2B10、CYP3A11和CYP3A25mRNA表達(dá)的影響 與空白組比較，TSG低劑量和高劑量分別作用3、5、7d后對 CYP2B10、CYP3A11和 CYP3A25mRNA 的表達(dá)無顯著性影響，見表2。

3 討 論

藥物在體內(nèi)的過程受到多種因素的共同調(diào)節(jié)與影響。藥物代謝酶系統(tǒng)與轉(zhuǎn)運體都是影響藥物代謝動力學(xué)過程的關(guān)鍵因素。細(xì)胞色素P450是以血紅素為輔基的B族細(xì)胞色素超家族蛋白酶，其主要功能是對藥物和部分致癌物質(zhì)進行生物轉(zhuǎn)化［5］。藥物的專屬代謝酶能夠被同時應(yīng)用的其他藥物誘導(dǎo)或抑制，通過藥物之間的代謝性相互作用導(dǎo)致組織或血液中的底物或代謝產(chǎn)物濃度升高或降低，甚至引起毒性物質(zhì)在體內(nèi)的蓄積，從而影響臨床用藥的療效和安全性［6-7］。

CYP1A、CYP2E和CYP3A是CYP酶系中重要的藥物代謝酶，調(diào)控大多數(shù)臨床藥物的代謝。CYP1A2是CYP1A中最重要的亞家族，其含量約占肝臟CYP總量的13%。研究發(fā)現(xiàn)CYP1A2在咖啡因、非那西汀、維拉帕米、對乙酰氨基酚、普萘洛爾、丙咪嗪以及硝苯地平等20余種藥物的代謝中發(fā)揮重要作用［8-9］。此外，CYP3A亞家族中CYP3A4是成人肝臟中最重要的成分，約占CYP總量的40%，能催化代謝60%以上的臨床治療藥物，如可的松、紅霉素、卡馬西平、咪達(dá)唑侖、利多卡因、奧美拉唑、雌二醇、辛伐他汀等［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)，TSG能夠抑制CYP1A2和CYP3A4基因表達(dá)，表明TSG在與經(jīng)CYP1A2和CYP3A4代謝的藥物聯(lián)合用藥時，可能會減慢對其他藥物的代謝，應(yīng)適時調(diào)整聯(lián)合用藥的給藥劑量，避免因為藥物之間的代謝性相互作用引起藥物蓄積，從而影響藥物的療效和安全性。

CYP2E亞家族中尤其以CYP2E1最為重要，CYP2E1約占肝臟CYP總量的7%，目前已經(jīng)確定的CYP2E1的底物已達(dá)70多種，如醋氨酚、乙醇、吸入性含氟麻醉劑、茶堿、工業(yè)和家庭常用的芳香族類化合物等，這些物質(zhì)在體內(nèi)經(jīng)CYP2E1催化后可氧化生成毒物或致癌物質(zhì)，從而嚴(yán)重影響藥物的療效和增加不良反應(yīng)的發(fā)生［12-14］。本研究發(fā)現(xiàn)TSG能夠誘導(dǎo)CYP2E1基因表達(dá)，提示TSG與其他通過CYP2E1代謝的藥物聯(lián)用時，很可能會導(dǎo)致其他藥物代謝加快，進而影響藥物療效。

值得一提的是，本研究發(fā)現(xiàn)TSG對CYP4A14基因表達(dá)具有抑制作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，CYP4A14的表達(dá)增加與脂質(zhì)過氧化損傷程度密切相關(guān)，通過造成體內(nèi)氧化-抗氧化水平失衡，進而導(dǎo)致肝內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量活性氧自由基和脂質(zhì)過氧化物，從而引起肝臟炎癥反應(yīng)［15-17］。本研究發(fā)現(xiàn)TSG能夠抑制CYP4A14基因表達(dá)，提示TSG可能影響肝臟內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，其具體作用機制值得進一步的探討。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)TSG對CYP1A2、CYP3A4以及CYP4A14基因表達(dá)具有抑制作用，對CYP2E1基因表達(dá)具有誘導(dǎo)作用，對CYP2B10、CYP3A11和CYP3A25基因表達(dá)無顯著性影響。本研究初步評價了TSG對小鼠CYP亞家族基因表達(dá)的影響，為其在臨床應(yīng)用中產(chǎn)生相互作用的可能性提供了依據(jù)，但有關(guān)TSG對CYP酶活性影響具體機制還有待進一步的研究。

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