伊洛馬司他聯合卡培他濱對人喉癌hep-2細胞的影響＊

李 黎，張少容，熊輝強，高樹峰，蘭 寧

（南昌大學第二附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科 330006）

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類Zn2＋依賴的蛋白水解酶，參與細胞外基質的降解與組織重塑，可降解基底膜從而促進喉癌細胞的侵襲和轉移。伊洛馬司他是羥肟家族中一種有效的基質金屬蛋白酶抑制劑（matrix metallo-proteinase inhibitors，MMPI），其與存在于所有蛋白酶中的Zn原子的活性中心相結合，從而抑制MMP的活性，進一步抑制喉癌的侵襲與轉移［1-2］。本實驗通過伊洛馬司他、化療藥物卡培他濱兩藥單獨和聯合處理喉癌hep-2細胞，觀察其對hep-2細胞的影響，并探討伊洛馬司他在抗腫瘤過程中的具體作用機制，為喉癌的聯合化療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）試劑：RPMI1640培養基購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰酶，北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自北京索萊寶科技有限公司；MTT購自Sigma公司；RT-PCR試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；PI／annexinV凋亡盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；卡培他濱，大連美倫醫藥科技發展有限公司；伊洛馬司他購自美國Santa Cruz公司。（2）細胞株：人喉癌細胞株hep-2，購于南京凱基生物科技發展有限公司。將細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液培養，其中青霉素、鏈霉素各100μ／mL，長滿后用0.25%胰酶消化傳代。（3）引物：根據prime 5.0軟件設計引物，由金斯瑞生物科技有限公司合成。MMP-9引物（362bp）的上游序列為5′-CGG CAC CTC TAT GGT CCT C-3′，下游序列為 5′-CAC TTG TCG GCG ATA AGG AA-3′。內參引物β-actin（434bp）上游序列為5′-CGG GAA ATC GTG CGT GAC-3′，下游序列為5′-TGG AAG GTG GAC AGC GAG G-3′。

1.2 甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測hep-2細胞的抑制率 取處于對數生長期的hep-2細胞，制成單細胞懸液，調整細胞數為7.5×104／mL接種于96孔細胞板，每孔100μL，待細胞貼壁后加藥。伊洛馬司他單獨作用組給予含伊洛馬司他濃度分別為2.5、5、10、20、40μg／mL的培養液100μL；卡培他濱單獨作用組給予含卡培他濱濃度分別為50、100、200、400、800μg／mL的培養液100μL，同時設立DMSO的陰性對照組、1640培養基空白對照組。每組每個濃度下設5個復孔，培養24h后，每孔加入20μL的 MTT（5mg／mL），孵育4h后，棄上清液，加入DMSO，終止反應。微振蕩5min后，于酶標儀波長490 nm處測吸光度（A）。以上各組實驗重復3次。抑制率（%）＝（1-治療組A值／對照組A值）×100%。用SPSS13.0軟件求出IC10及IC50值。

MTT聯合用藥實驗選用兩個濃度組：（1）兩種藥物的IC10濃度組（即8μg／mL伊洛馬司他＋100μg／mL卡培他濱），該濃度組細分為3組，伊洛馬司他＋卡培他濱聯合濃度（8＋0）μg／mL組、伊洛馬司他＋卡培他濱聯合濃度（100＋0）μg／mL組，伊洛馬司他＋卡培他濱聯合濃度（8＋100）μg／mL組。（2）2種藥物較接近半數抑制度（IC50）且小于IC50的濃度組（40 μg／mL伊洛馬司他＋400μg／mL卡培他濱），同（1）中方法細分為3組。實驗方法同前計算出各組的抑制率。采用Q值判斷伊洛馬司他和卡培他濱聯合用藥的性質。Q＝Ea＋b／（Ea＋Eb-Ea＊Eb）。公式中Ea代表單藥A的抑制率，Eb代表單藥B的抑制率，Ea＋b代表兩藥聯用的抑制率。Q＞1.15為兩藥協同作用，0.85≤Q≤1.15為相加作用，Q＜0.85為拮抗作用。實驗測得的IC10供后續實驗使用。

1.3 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測hep-2細胞 MMP-9mRNA表達的變化 取對數生長期的hep-2細胞，以每孔5×104的密度接種于6孔細胞培養板，待細胞鋪滿后加藥，分為4組：（1）伊洛馬司他組（8μg／mL）；（2）卡培他濱組（100μg／mL）；（3）聯合用藥組（8μg／mL伊洛馬司他＋100μg／mL卡培他濱）；（4）對照組（未用藥）。培養24后棄上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌兩遍，按Trizol試劑盒操作說明書提取細胞總RNA，并對RNA定量測定。取4μg總RNA為模板，按HiFi-MMLV cDNA第1鏈合成試劑盒操作說明書操作，將RNA逆轉錄成cDNA。以3μL cDNA為模板，進行擴增，擴增條件為：94℃變性45s，60.5℃退火60s，72 ℃延伸60s，35個循環。PCR擴增產物行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，通過Bandleader軟件分析各條帶，以目的基因熒光亮度／β-actin熒光亮度表示PCR產物含量。實驗重復3次，取平均值作為實驗結果。

1.4 流式細胞儀檢測hep-2細胞的凋亡 取對數生長期的hep-2取對數生長期的hep-2細胞，同前藥物分組處理hep-2細胞，24h后按PI／AnnexinV-FITC試劑盒操作標記細胞和流式細胞術檢測細胞凋亡，每組重復3次。細胞凋亡比率A1按以下公式計算：A1（%）＝亞二倍峰細胞數／細胞總數×100%。

1.5 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料用±s表示，MTT單藥組內采用單因素方差分析加最小顯著差（least significant difference，LSD）法兩兩比較各濃度的抑制率，MTT聯合實驗采用t檢驗。RT-PCR與流式細胞術組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞生長抑制 MTT法檢測各組細胞生長抑制情況，結果表明，hep-2細胞經不同濃度伊洛馬司他、卡培他濱單獨處理24h后，細胞生長程度受到不同程度的抑制（表1、2），且抑制程度依賴于藥物劑量的增加，不同濃度抑制率間的差異有統計學意義（伊洛馬司他組F＝144.167，P＜0.05；卡培他濱組F＝60.131，P＜0.05）。進一步LSD法兩兩比較各濃度的抑制率，伊洛馬司他組中任意濃度間差異均有統計學意義（P＜0.05），卡培他濱組中任意兩濃度間差異也均有統計學意義（P＜0.05）。經SPSS軟件求得伊洛馬司他的10%的細胞抑制濃度（IC10）和IC50分別為8μg／mL和130μg／mL，卡培他濱的IC10與IC50分別為100μg／mL和910μg／mL。在聯合用藥實驗中采用t檢驗比較，伊洛馬司他＋卡培他濱聯合濃度（8±100）μg／mL的抑制率明顯高于濃度（8±0）μg／mL和濃度（0±100）μg／mL，且差異均有統計學意義（t＝8.421，P＜0.05；t＝7.009，P＜0.05）；聯合濃度（40±400）μg／mL的抑制率也明顯高于濃度（40±0）μg／mL和（0±400）μg／mL，差異均具有統計學意義（t＝10.226，P＜0.05；t＝8.879，P＜0.05）。伊洛馬司他＋卡培他濱聯合濃度（8±100）μg／mL組Q值為1.45，為協同作用；濃度（40±400）μg／mL組 Q值為1.05，為相加作用。

表1 伊洛馬司他對hep-2細胞的增殖抑制情況（±s）

表1 伊洛馬司他對hep-2細胞的增殖抑制情況（±s）

伊洛馬司他用藥濃度（μg／mL） A值 抑制率（%）2.5 1.154±0.004 2.85±0.34 5.0 1.112±0.005 6.42±0.44 10.0 1.076±0.006 9.34±0.61 20.0 1.012±0.016 14.67±1.53 40.0 0.823±0.039 30.67±3.05

表2 卡培他濱對hep-2細胞的增殖抑制抑制情況（±s）

表2 卡培他濱對hep-2細胞的增殖抑制抑制情況（±s）

卡培他濱用藥濃度（μg／mL） A值 抑制率（%）50 0.177±0.002 3.24±0.96 100 0.166±0.004 9.31±1.88 200 0.134±0.005 27.08±3.12 400 0.118±0.004 35.54±2.50 800 0.107±0.004 41.56±1.93

2.2 RT-PCR檢測各組hep-2細胞MMP-9mRNA表達的變化 RT-PCR結果表明，各組均檢測到MMP-9的表達。半定量行t檢驗顯示，卡培他濱與正常組相比，MMP-9的表達差異無統計學意義（t＝2.570，P＞0.05）；伊洛馬司他組與聯合用藥組的MMP-9mRNA的表達水平均低于正常組，且差異有統計學意義（P＜0.05）；并且聯合用藥組 MMP-9mRNA的表達水平低于伊洛馬司他組，差異有統計學意義（P＜0.05）。對照組為0.557±0.017，伊洛馬司他組為0.484±0.021，卡培他濱組為0.530±0.006，聯合用藥組為0.369±0.002。

2.3 流式細胞術檢測各組hep-2細胞凋亡率的變化 hep-2細胞凋亡率對照組為（9.47±0.81）%，伊洛馬司他組為（14.44±1.09）%，卡培他濱組為（16.33±1.20）%，聯合用藥組為（23.47±1.16）%。經t檢驗實驗結果顯示，伊洛馬司他組和卡培他濱組處理hep-2細胞24h后，凋亡率均高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；聯合用藥組處理hep-2細胞24h后，凋亡率高于其他各組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤，浸潤和轉移是喉癌的主要的生物學特性，也是喉癌患者死亡的主要原因。細胞外基質（ECM）和基底膜（BM）的降解是腫瘤侵襲和轉移的首要環節，MMPs幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，因此在腫瘤侵襲、轉移中起關鍵性作用。而現在喉癌中研究最多最廣的是Ⅳ型膠原酶（MMP-9和MMP-2）。MMP-9屬于明膠酶類，它可降解BM的主要成分膠原Ⅳ，其能與整合素結合從而促進腫瘤細胞的生長，調節腫瘤細胞黏附性和運動能力；也能促進腫瘤細胞分泌血管內皮生長因子（VEGF）加速腫瘤轉移［3-4］。最新研究還發現，MMP-9可切割蛋白酶連接蛋白-1（PN-1）來調控腫瘤的轉移［5］。MMPIs是當前抗腫瘤藥物中很有發展前景的一類，從來源可分為天然和人工合成兩大類。組織基質金屬蛋白酶抑制劑（Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs）是MMPs的天然抑制劑，其和MMPs的表達不平衡在喉癌的浸潤和轉移過程中起重要作用［6］。合成的MMPIs主要是設計來抑制腫瘤細胞產生的MMPs的致瘤潛能，目前主要有馬立馬司他，BAY129566，伊洛馬司他等。

有關基質金屬蛋白酶及其抑制劑在腫瘤中的研究在國內外已見較多報道，例如Sun等［7］研究發現，由病毒介導的RNA干擾MMP-9基因沉默可以抑制喉鱗狀細胞癌浸潤和生長；李為等［8］認為TIMP-1的表達和腫瘤的發生具有明顯的負相關性；Almholt等［9］也發現采用伊洛馬司他（GM6001）處理的乳腺癌MMTV-PyMT轉基因小鼠與安慰劑處理的小鼠相比，乳腺癌的平均轉移量減少了至少10倍。

化療藥物卡培他濱是一種氟尿嘧啶氨甲酸酯類藥物，它是氟尿嘧啶（5-FU）的前體，口服后以完整藥物形式經腸黏膜進入肝臟，并轉化為細胞毒性成分5-FU，起到靶向性殺傷腫瘤細胞作用，具有高效、低毒的特點［10］，其存在的問題是單藥卡培他濱在治療癌癥時的效果并不太滿意。

在本實驗中使用人工合成MMPIs伊洛馬司他、卡培他濱單獨和聯合處理喉癌hep-2細胞。伊洛馬司他又名GM6001，一種羧氨酸修飾的二肽，可抑制 MMP-1，-2，-3，-8，-9的活性［2，11］。它不但能可逆性結合蛋白酶中含鋅離子的活性區，直接抑制蛋白酶的活性，還可抑制MMPs前體轉化為有活性的MMPs，從而抑制腫瘤的浸潤與轉移。實驗結果顯示伊洛馬司他和卡培他濱單獨用藥24h后都可抑制喉癌hep-2細胞的生長，且呈現濃度依賴性。當伊洛馬司他藥物濃度從2.5μg／mL成倍增加至40μg／mL時，它對hep-2細胞的抑制率逐漸增加，此藥的IC10與IC50分別為8μg／mL和130μg／mL；化療藥物卡培他濱藥物劑量從50μg／mL成倍增加至800μg／mL時，它對hep-2細胞的抑制率也隨之增加，此藥物的IC10與IC50分別為100μg／mL和910μg／mL。在伊洛馬司他聯合卡培他濱用藥24h后發現，其對hep-2細胞的抑制率在相同劑量下明顯高于兩種藥物單獨用藥24h，且伊洛馬司他與卡培他濱聯合用藥（8＋100）μg／mL濃度組中兩藥為協同作用，（40＋400）μg／mL濃度組中為相加作用，這說明伊洛馬司他聯合卡培他濱對hep-2細胞的抑制效應強于二者單獨用藥，且在低濃度時具有協同作用。同時，作者使用流式細胞術檢測喉癌hep-2細胞的凋亡，為避免非凋亡性殺傷的細胞太多造成流式細胞儀檢測碎片太多，作者選取兩種藥物的IC10濃度進行檢測，作用24h后顯示伊洛馬司他和卡培他濱單獨用藥都可誘導hep-2的凋亡過程，兩種藥物聯合作用后，hep-2細胞凋亡的程度明顯增加。這表明，伊洛馬司他不但可以抑制hep-2細胞的增殖，還可誘導其凋亡，從而抑制喉癌的發生、發展；并且伊洛馬司他聯合卡培他濱用藥對hep-2細胞的影響明顯優于其單獨用藥。

此外，本研究中采用RT-PCR檢測喉癌hep-2細胞中MMP-9mRNA表達水平，發現MMP-9mRNA在hep-2細胞中表達陽性，當伊洛馬司他IC10濃度單獨用藥24h后，hep-2細胞中MMP-9mRNA的表達水平下降。蘭菁等［12］在宮頸癌HCE1多細胞球體浸潤人臍靜脈內皮單層細胞模型中得到與本實驗類似的結果，GM6001干預后的宮頸鱗癌HCE1多細胞球體MMP-9的表達明顯降低。這表明伊洛馬司他對hep-2細胞的生長抑制、誘導細胞凋亡作用以及聯合卡培他濱用藥的作用，可能與下調MMP-9mRNA的表達，抑制 MMP-9的活性有關。本實驗還發現卡培他濱不能降低MMP-9mRNA的表達水平，但當兩種藥物在IC10濃度聯合作用時，MMP-9mRNA的表達水平不僅明顯低于對照組，且低于伊洛馬司他單獨用藥組，提示卡培他濱雖然對MMP-9mRNA的表達水平沒有影響，但很有可能可促進伊洛馬司他對MMP-9mRNA活性的抑制作用，這也進一步說明兩藥物在IC10濃度聯合作用時具有協同作用。

綜上所述，伊洛馬司他與卡培他濱聯合用藥可明顯增強單藥對喉癌hep-2細胞的抑制效應和誘導細胞凋亡作用，同時推測伊洛馬司他的作用機制可能是下調MMP-9的表達水平，從而抑制喉癌的浸潤和轉移。這些都提示MMPI伊洛馬司他有可能作為臨床化療藥物良好的輔助藥物，為喉癌和其他惡性腫瘤的聯合藥物治療提供了一定的實驗依據。但是，伊洛馬司他和卡培他濱聯合應用的不良反應是否減少，最為適合的配比劑量，在臨床上實現的可能性還有待進一步實驗研究。

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