黏附因子CD44的活化狀態及其在腫瘤靶向治療中的研究進展＊

侯利丹 綜述，高 鋒 審校

（上海交通大學附屬第六人民醫院中心實驗室 200233）

CD44（cluster of differentiation 44）指白細胞分化抗原簇第44號，是一類重要的黏附分子，廣泛分布于細胞表面，如淋巴細胞、單核細胞、成纖維細胞、內皮細胞等［1］。不同細胞表面CD44與透明質酸（HA）結合活性不同，活化狀態存在很大差異。許多正常細胞表面CD44處于相對靜止狀態，而許多腫瘤細胞表面CD44處于高度活化狀態，能與其主要配體HA結合，參與腫瘤的發生、發展及轉移等［2-6］。目前，有關CD44活化的調控機制仍未完全闡明，但隨著對CD44研究的不斷深入，其與腫瘤的關系越來越受關注，特別是以CD44為靶點進行腫瘤靶向治療已經成為腫瘤研究的焦點［7-9］。本文對CD44分子活化狀態及其在腫瘤靶向治療中的作用綜述如下。

1 CD44的結構與生物學功能

CD44基因由一組高度保守的外顯子組成，約有50～60 kb，位于人的第11號和小鼠的第2號染色體上［10］。根據其外顯子的表達方式不同可分為兩型：CD44標準型（CD44s）和CD44變異型（CD44v）。CD44蛋白結構可分為3部分：N-端結構域、跨膜結構域和C-端結構域。N-端結構域含有與HA結合的必須序列，是CD44發揮生物學功能的重要區域，C-端結構域可作為蛋白激酶C的底物被磷酸化，參與信號轉導過程，并且通過錨蛋白與細胞骨架相連。CD44蛋白的主要功能可歸納為：（1）作為歸巢受體介導淋巴細胞與毛細血管后小靜脈中的高柱狀內皮細胞結合，促使淋巴細胞穿過血管壁回到淋巴組織；（2）參與淋巴細胞，尤其是T淋巴細胞及自然殺傷細胞等的激活，在激活過程中，CD44與其主要配體HA或相應抗體結合，作為共刺激分子，能夠增強淋巴細胞的功能；（3）參與細胞間的黏附，促進成纖維細胞和淋巴細胞與HA、硫酸軟骨素及層粘連蛋白等細胞外基質結合；（4）能與細胞骨架蛋白結合，參與細胞偽足形成，并與細胞的遷移運動有關［11-12］。

2 細胞表面CD44的活化狀態

CD44是HA在細胞表面最主要的受體。HA是一種由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸為結構單元的高分子黏多糖，為細胞外基質的主要組成部分，能夠與腫瘤細胞表面CD44結合，參與腫瘤的侵襲和轉移。但是CD44與HA的結合并不完全是自發的。CD44處于3種不同狀態：（1）靜止狀態，不能與HA結合；（2）可誘導激活狀態，CD44需要在特異抗CD44單抗或者激活劑（如佛波酯）的誘導下，才能夠被激活，與HA結合；（3）組成性激活狀態，不需要任何激活劑，CD44即可以與HA結合［13］。CD44的活化狀態主要體現在與其主要配體HA的結合活性上，受到多種因素的影響。研究發現，大部分造血系統細胞表面CD44處于誘導激活狀態，不能自發結合HA［14］，如B淋巴細胞和T淋巴細胞，經佛波酯或CD44抗體刺激可使其表面CD44受體活化，與HA結合。Levesque等［4］觀察到新鮮分離的人外周血單核細胞和淋巴細胞均不能與HA結合，在體外培養8～16h后，部分單核細胞即可與HA結合，植物血凝素和抗體OKT3刺激可顯著提高單核細胞與HA結合活性，而大部分淋巴細胞仍不能與HA結合，提示外周血單核細胞表面CD44處于可誘導激活狀態，經誘導可與HA結合，許多淋巴細胞表面CD44處于靜止狀態，不能與HA結合。許多腫瘤細胞如乳腺癌細胞、肺癌細胞，其表面CD44能自發結合HA，處于組成性激活狀態［15-16］。

3 CD44不同活化狀態的調控機制

CD44的不同活化狀態究竟受何調控，目前仍未完全闡明。研究發現，體外培養后多數單核細胞表達高相對分子質量CD44v，具有活性，而大部分淋巴細胞不表達，處于靜止狀態，僅少數表達CD44v6的淋巴細胞處于活化狀態［17］，表明CD44與HA的結合可能與CD44異構體相關。Perschl等［18］發現CD44細胞質段缺失可使T淋巴瘤細胞喪失與HA結合的活性，但是將細胞質段缺失的CD44通過二硫鍵結合形成CD44二聚體后，CD44能夠與HA結合，表明CD44細胞質段可能參與CD44在細胞膜上的分布，促使CD44在細胞膜上的聚集，誘導其與HA結合，該研究提示CD44在細胞表面的分布變化，可調節其與HA的結合。Katoh等［3］發現中國倉鼠卵巢細胞CD44糖基化缺失株可以結合HA。用糖基化抑制劑處理CD44失活的細胞株，可以使CD44相對分子質量降低并促使其與HA結合，提示CD44過度糖基化可能占據其與HA的結合區域，導致CD44不能與HA結合。Peck等［19］將CD44陰性的人黑色素瘤細胞和鼠T淋巴瘤細胞轉染CD44，轉染可以引起其與HA結合。但是，Swiss小鼠胚細胞NIH3T3轉染CD44后，仍不能結合HA，提示CD44與HA結合同時也受細胞類型的影響［5］。HA與CD44的結合也受到HA狀態的影響，有學者認為交聯狀態的HA可能提高HA與CD44的親和力［20］。綜上所述，CD44與 HA結合主要與 CD44構型［21］、受體分布［18］、糖基化［3，22］等相關，同時也受細胞類型［5］、HA 自身存在狀態［20］等調控。

4 腫瘤細胞活化的CD44作為靶點在腫瘤靶向治療中的應用

許多正常細胞與腫瘤細胞均表達CD44，但其活化狀態不盡相同。Tzircotis等［5］檢測乳腺癌細胞 MDA-MB-231、MDAMB-468及Swiss小鼠胚細胞NIH3T3表面CD44的表達水平和活性，發現上述細胞均高表達CD44，正常小鼠胚細胞NIH3T3與HA結合活性極低，乳腺腫瘤細胞MDA-MB-231、MDA-MB-468與HA結合活性很高；Bachar等［23］也證實頭頸癌患者腫瘤細胞表面CD44能結合HA，瘤旁正常組織不能與HA結合；本實驗室研究發現，正常細胞外周血單個核細胞PBMCs、Swiss小鼠胚細胞NIH3T3、人皮膚原代細胞、小鼠肺成纖維細胞L929、小鼠成骨細胞MC 3T3-E1等正常細胞高表達CD44，但是CD44與HA結合活性極低，處于相對靜止狀態；人乳腺癌細胞 MDA-MB-231、MDA-MB-468、Hs578T、BT-549細胞表面也高表達CD44，且CD44與HA結合活性很強，處于高度活化狀態，與前人研究結果相符。以上研究提示，CD44在正常細胞上多處于靜止狀態，不具有與HA結合的活性，在腫瘤細胞上則處于高度活化狀態，能夠結合HA。

基于CD44在正常細胞和腫瘤細胞表面活化狀態差異，提示腫瘤細胞表面高度活化的CD44能夠作為理想的靶點分子，用于腫瘤靶向治療。

目前，已有許多學者以CD44為靶點分子，通過阻斷CD44與HA結合從而降低腫瘤轉移［24-26］，進行腫瘤靶向治療。Zawadzki等［27］運用CD44s受體蛋白、CD44v10受體蛋白和CD44單克隆抗體阻斷小鼠B16F10黑色素瘤CD44與其配體HA結合，發現在不進行任何其他處理的情況下，CD44s受體蛋白和CD44v10受體蛋白可使腫瘤在肺部的轉移量分別降低70%和60%，CD44單克隆抗體也取得了基本相同的效果。

近年來，隨著納米載藥系統研究的興起，納米顆粒連接靶向分子HA，針對腫瘤表面CD44進行腫瘤靶向治療取得很大進展。Choi等［28］將HA經過疏水性修飾制作成球形HA納米顆粒（HA-NPs），HA-NPs中間為疏水核心，可以運載疏水性抗腫瘤藥物，用熒光標記HA-NPs，分別作用于高表達CD44的鱗狀癌細胞SCC7和正常非洲綠猴腎纖維細胞CV-1，結果顯示SCC7可以有效攝取HA-NPs，而CV-1沒有明顯攝取。將SCC7細胞懸液種入裸鼠背部皮下，構建裸鼠鱗癌模型，尾靜脈注射熒光標記的HA-NPs檢測其在裸鼠體內的靶向性，結果表明HA-NPs靶向結合癌細胞表面CD44，有效提高其腫瘤部位的濃度。Auzenne等［29］發現HA-PTX對CD44陽性人卵巢癌細胞SKOV-3ip和NMP-1的殺傷活性明顯大于單純PTX，加入過量游離的HA能夠阻斷這種增強的殺傷活性，提示HA-PTX通過靶向細胞表面CD44，達到增強殺傷靶向細胞的效果。Rivkin等［30］在PTX脂質體上連接HA制得帶靶向性的PTX脂質體（PTX-GAGs），為了明確PTX-GAGs是否與腸癌細胞CT-26高表達的CD44結合，將細胞與PTX-GAGs共孵育0.5、6、12h后，加入CD44單克隆抗體檢測CD44表達，結果發現0.5h時完全不能檢測到細胞CD44表達，6h時約半數細胞可檢測到CD44表達，12h時所有細胞均能檢測到CD44表達，說明0.5h時PTX-GAGs與CD44結合，占據了CD44全部位點，12h后完全進入細胞，釋放了CD44結合位點，證實PTX-GAGs主要依賴與CD44結合，靶向進入細胞。小鼠體內實驗也顯示，PTX-GAGs主要集中于腫瘤部位，在同樣的處理條件下，PTX-GAGs抑瘤效果達市售藥泰素的4倍。這種現象不僅局限于腸癌細胞，游離多西環素作用于小鼠肺腺癌細胞D122 1h，藥物幾乎未進入細胞，不對細胞造成殺傷，而DOX-GAGs處理1h后，細胞內明顯呈現藥物聚集，說明藥物可以通過CD44與HA靶向結合主動進入細胞內，顯著提高細胞內藥物濃度。Bachar等［23］研究了以HA為靶向分子的絲裂霉素脂質體（MMC-GAGs）對5例頭頸癌患者的作用，結果顯示腫瘤組織CD44與HA有很高的結合活性，而瘤旁正常細胞CD44基本不結合HA，體外細胞殺傷實驗結果也證實MMCGAGs選擇性靶向殺傷頭頸癌細胞，與PTX相比明顯提高殺傷活性，而未殺傷瘤旁正常細胞，證明MMC-GAGs在體內應用時，HA僅與腫瘤細胞表面CD44結合，將藥物運輸至腫瘤部位，不會殺傷表達CD44的正常細胞，在提高藥物療效的同時也保證了體內用藥的安全性。Coradini等［31］將透明質酸丁酸納米顆粒（HA-But）分別作用于高表達CD44的肝癌細胞HepB3和低表達CD44的肝癌細胞HepG2上，發現HA-But對細胞的抑制率較單純丁酸提高了10倍左右，在相同條件下HA-But對HepB3的殺傷明顯高于 HepG2，但是充分延長作用時間HA-But對低表達CD44的HepG2也有明顯殺傷作用，提示HA-But與CD44結合后很快進入細胞，CD44可重新結合HA，保證藥物在細胞內的濃度，抑制腫瘤生長。

以上研究表明，腫瘤細胞表面活化狀態的CD44是腫瘤治療的一個理想靶點，運用 HA［26］、CD44單克隆抗體［27］、CD44受體蛋白［27，32］等阻斷CD44與HA的結合，可以有效減小腫瘤體積，抑制腫瘤轉移；以HA為靶向分子制作藥物靶向CD44能夠有效提高藥物在腫瘤部位的聚集，增加藥物的生物利用度，達到靶向治療腫瘤的效果。

5 展 望

綜上所述，CD44以不同的狀態廣泛分布于各類正常和腫瘤細胞上，特別是活化狀態的CD44在腫瘤發生、發展及轉移中發揮著重要作用，以腫瘤細胞表面CD44為靶點進行腫瘤的靶向治療為腫瘤治療提供了新的方向。但關于CD44與HA結合的調控機制尚不完全清楚，有待進一步深入地研究。

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