肝細胞生長因子及其受體與神經纖毛蛋白1在骨肉瘤中的表達及意義

吳同申，孟 彥，彭圣智

（1.濟寧醫學院附屬醫院骨科，山東濟寧272029；2.山東大學第二醫院骨科，濟南250033；3.濟寧醫學院病理學教研室，山東濟寧272067）

骨肉瘤臨床中常見，患者進展較快，且病變進展與基因和蛋白有密切關系。肝細胞生長因子（HGF）又稱為離散因子，可以對肝細胞進行強烈而有效的刺激，引起肝細胞的再生。HGF在作用過程中可以與肝細胞生長因子受體（C-met）結合而發揮生物學作用。而C-met由原癌基因C-met編碼表達，C-met是Ⅱ型氨酸激酶受體，正常組織和細胞中表達極少，在惡性腫瘤中表達明顯升高［1］。HGF與C-met結合后可以促進多種腫瘤的增殖、遷移和血管的生成，對腫瘤的侵襲和轉移有重要促進作用。神經纖毛蛋白1（NRP1）是SEMA3F的受體，其不僅具有促進神經導向因子的生長，而且在腫瘤中的作用受到學者的關注［2］。本實驗應用免疫組織化學技術檢測骨肉瘤組織中HGF、C-met和NRP1的表達情況，并進行臨床對照觀察，探討其臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集濟寧醫學院附屬醫院及山東大學第二醫院、山東大學齊魯醫院2008年1月至2010年11月骨肉瘤手術后的留取的蠟塊及臨床資料作為觀察組，納入均符合WHO在2008版中關于骨肉瘤的診斷標準，并重新切片并由病理醫師再次確診，患者術前均未進行放療和化療。本組共選取70例，男40例，女30例，年齡11～38歲，平均18.7歲。同時選取經病理證實為正常的成熟骨組織并經脫鈣后的蠟塊及臨床資料50例作為對照組，男26例，女24例，年齡12～36歲，平均17.8歲。2組在一般臨床特征中的比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 HGF、C-met和NRP1蛋白的檢測 實驗用的兔抗人HGF、C-met和NRP1蛋白的濃縮液均購自中杉金橋生物技術公司，HGF、C-met和NRP1蛋白的檢測均應用免疫組化二步法，均由病理技師進行操作，設陽性對照和陰性對照，嚴格質量控制。

1.2.2 HGF、C-met和 NRP1蛋白的判斷方法 HGF、C-met和NRP1蛋白陽性染色定位于細胞質和（或）細胞膜上，以出現棕黃的顆粒定為陽性細胞，選擇陽性細胞集中的區域（熱點區）并計數5個400倍視野的陽性表達細胞數，以平均每高倍鏡視野的陽性腫瘤細胞數大于或等于25%即判斷為陽性，以小于25%為陰性。計算陽性率。

1.3 統計學處理 應用SAS 6.12統計軟件進行分析，應用χ2檢驗、相關分析及生存分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2 組中HGF、C-met和NRP1蛋白表達陽性率的比較觀察組中HGF、C-met和NRP1蛋白表達的陽性率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 觀察組中不同臨床特征患者HGF、C-met和NRP1蛋白表達的比較 觀察組中HGF、C-met和NRP1蛋白表達的陽性率與腫瘤的轉移、脈管浸潤、臨床分期及Ki67的表達密切相關，見表2。

2.3 觀察組中HGF、C-met和NRP1表達的相關性 經線性相關分析顯示，觀察組中 HGF和 C-met（r＝0.47，P＝0.016 5）、HGF和 NRP1（r＝0.43，P＝0.031 2）、C-met和NRP1（r＝0.48，P＝0.010 9）的表達具有正相關性。

表1 2組中HGF、C-met和NRP1蛋白表達陽性率的比較［n（%）］

表2 觀察組中不同臨床特征患者HGF、C-met和NRP1蛋白表達的比較［n（%）］

3 討 論

骨肉瘤在病變進展中增殖明顯，且出現明顯的浸潤和轉移。NRP1是細胞表面相對分子質量為102×103的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其常表達在內皮細胞和一些腫瘤細胞中，是Semaphorin3A和血管內皮生長因子（VEGF）的受體，在神經軸突的生長、血管的生成及腫瘤的轉移中起重要作用［3］。也有觀點認為NRP1表達在所有腫瘤細胞中，即分布在腫瘤血管內皮細胞上，也直接分布在腫瘤細胞中［4］。如果NRP1與VEGF結合，可以有效地促進腫瘤血管的生成及腫瘤細胞的增殖。也有人發現NRP1可以有效地下調腫瘤細胞間的黏附作用，使腫瘤細胞易于脫離原發灶而出現轉移［5］。HGF和C-met具有明顯的協同作用，其高表達時引起β2連環蛋白的酪氨酸殘基發生磷酸化，使其不能與E-鈣黏蛋白胞內部分結合形成復合體，破壞了E-鈣黏蛋白和細胞骨架的連接作用，最終引起細胞間的黏附作用減弱［6-7］。也有觀點認為HGF是通過增加整合素的功能活性，而不是改變其在細胞膜表面的表達量來促進細胞與胞外基質成分的黏附作用［8］。多個學者的研究則顯示，HGF／C-met的作用過程中，對腫瘤的淋巴管生成也有重要促進作用［9-10］。因此HGF／C-met的作用可能是多元性的，其影響因素也較多。

研究結果顯示，觀察組中HGF、C-met和NRP1高表達，提示3種蛋白在腫瘤進展中有明顯的促進作用，也顯示出HGF、C-met和NRP1作為癌基因起到的類似作用。相關分析顯示HGF、C-met和NRP1之間均呈正相關性。由于HGF／C-met被認為是經典的作用通路，而NRP1可以對此通路形成有效的促進作用，因此NRP1對HGF／C-met的表達有明顯的增強作用。由于NRP1、HGF／C-met均可以促進以VEGF誘發的血管生成，因此NRP1對 HGF／C-met的作用是否通過VEGF為中介分子尚有待更多實驗證實。本研究結果顯示，觀察組中HGF、C-met和NRP1蛋白表達的陽性率與腫瘤的轉移、脈管浸潤、臨床分期及Ki67的表達密切相關，提示3種蛋白參與了腫瘤的轉移、脈管浸潤和細胞的增殖過程。由于以上因素均與骨肉瘤的預后有關，因此聯合檢測 HGF、C-met和NRP1蛋白的表達可能對判斷預后有一定價值。即骨肉瘤中HGF、C-met和NRP1高表達患者的預后差。Ki67作為腫瘤細胞惡性增殖的重要指標，而HGF、C-met和NRP1均與Ki67表達的增殖指數有關，因此3種蛋白對腫瘤細胞的增殖也有明顯的促進作用，此結論也顯示出了HGF、C-met和NRP1高表達時的高增殖的腫瘤細胞，同時顯示出了高表達預示著患者的預后不良。

總之，骨肉瘤組織中 HGF、C-met和NRP1高表達，三者可能具有協同正向作用，使腫瘤快速生長、浸潤及轉移。術后聯合檢測HGF、C-met和NRP1的表達可能對判斷預后有一定價值。

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