反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定4種抗癲癇藥物的血藥濃度

周春華，張志清，朱輝梅

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，河北石家莊050000）

·論 著·

反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定4種抗癲癇藥物的血藥濃度

周春華，張志清*，朱輝梅

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，河北石家莊050000）

目的建立可同時(shí)測(cè)定拉莫三嗪、奧卡西平、苯妥英鈉和卡馬西平血藥濃度的反相高效液相色譜法。方法色譜柱為Diamonsil C18柱（150mm×4.6mm，5μm），以巴比妥為內(nèi)標(biāo)，流動(dòng)相為甲醇－乙腈－水（39∶10∶51，V/V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)225nm，流速1.0mL/min，柱溫25℃。結(jié)果該色譜條件下，拉莫三嗪、奧卡西平、苯妥英鈉、卡馬西平分離良好，4種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：拉莫三嗪Y＝0.155 1X＋0.096 3（r＝0.999 1），線性范圍1.0～40.0mg/L；奧卡西平Y(jié)＝0.121 7X＋0.179 7（r＝0.999 0），線性范圍2.0～80.0mg/L；苯妥英鈉Y＝0.063 4X＋0.078 2（r＝0.999 3），線性范圍2.0～80.0mg/L；卡馬西平Y(jié)＝0.210 9X＋0.017 0（r＝0.999 8），線性范圍1.0～40.0mg/L。4種藥物的方法回收率為90.5％～105.8％，日內(nèi)及日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于10％。4種藥物血清樣品－40℃保存5d及反復(fù)凍融3次性質(zhì)穩(wěn)定，處理血清樣品放置4h對(duì)測(cè)定無影響。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確，4種藥物互不干擾，可應(yīng)用于常用抗癲癇藥物的臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)。

色譜法，高壓液相；抗驚厥藥；血藥濃度

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見病，不少患者需長(zhǎng)期同時(shí)服用2種或2種以上抗癲癇藥物。拉莫三嗪（lamotrigine，LTG）、奧卡西平（oxcarbazepine，OXC）、苯妥英鈉（phenytoinum，PHT）和卡馬西平（carbamazepine，CBZ）均為臨床常用抗癲癇藥物，存在藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)的個(gè)體差異及藥物相互作用。為了實(shí)施個(gè)體化治療，提高臨床抗癲癇治療的有效性和安全性，同時(shí)為用藥過量的中毒診斷和處理提供可靠的科學(xué)依據(jù)，建立快速、準(zhǔn)確的測(cè)定抗癲癇藥物血藥濃度的方法就顯得十分必要。文獻(xiàn)中有采用熒光偏振免疫法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法的報(bào)道，但前者需分別測(cè)定，因此目前的研究趨向于HPLC法，在同一條件下測(cè)定多種藥物。本文建立了同時(shí)測(cè)定血清中4種抗癲癇藥物濃度的反相高效液相色譜法（reverse phase high performance liquid chromatography，RPHPLC）法，并進(jìn)行方法學(xué)考察。

1 材料與儀器

1．1 儀器：高效液相色譜儀包括515型泵、486紫外檢測(cè)器和Empower Application操作平臺(tái)（美國Waters公司）；LD5-10型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；XW-80A型渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1．2 試藥：巴比妥（內(nèi)標(biāo)，北京芳草醫(yī)藥化工研制公司；批號(hào)920105，純度＞99％）；LTG（中國食品藥品檢定研究院；批號(hào)100775-200401，純度＞99％）；OXC（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100657-200401，純度＞99％）；PHT（上海科興實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；批號(hào)100210-200401，純度＞99％）；CBZ（中國食品藥品檢定研究院；批號(hào)1429101，純度＞99％）；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件：色譜柱，Diamonsil C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相，甲醇－乙腈－水（39∶10∶51，V/V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)225nm；流速1.0mL/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量20μL；內(nèi)標(biāo)巴比妥。

2．2 溶液制備：對(duì)照品溶液配制，精密稱取LTG、 OXC、PHT、CBZ各25mg，分別加入到25mL量瓶中，甲醇定容；再分別取各溶液10mL于50mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配成濃度各為200mg/L的儲(chǔ)備液溶液，于5℃保存待用。分別精密取LTG和CBZ儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成濃度分別為2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密取OXC和PHT儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成濃度分別為4.0、10.0、20.0、40.0、80.0、120.0、160.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液配制，精密稱取巴比妥20mg，加入100mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液5mL于25mL量瓶中，甲醇定容，得濃度為40.0mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

2．3 血清樣品處理：血清樣品自然解凍，取200μL于離心管中，加內(nèi)標(biāo)溶液（40.0mg/L）100μL混勻，加提取液（乙酸乙酯）3mL，渦旋混合2min，離心（4 000r/min）5min，取2.75mL上清液于5mL離心管中，50℃水浴下氮?dú)饬鞔蹈桑?00μL流動(dòng)相復(fù)溶，進(jìn)樣。

2．4 方法學(xué)考察

2．4．1 專屬性：將空白血清、加入LTG、OXC、PHT、CBZ的血清模擬樣品、給藥后血清樣品，分別按“2.3”方法處理并進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，血清中內(nèi)源性物質(zhì)不干4種抗癲癇藥的測(cè)定，內(nèi)標(biāo)與LTG、OXC、PHT、CBZ完全分離，保留時(shí)間分別為3.1、4.2、6.7、10.0、11.2min。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血清；B.血清模擬樣品；C.給藥后血清樣品；1.內(nèi)標(biāo)；2.LTG；

2．4．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別精密吸取系列濃度的LTG、OXC、PHT、CBZ溶液各100μL于10mL塑料離心管中，50℃水浴下氮?dú)獯蹈桑尤胱匀唤鈨龅目瞻籽?00μL及內(nèi)標(biāo)溶液（40.0mg/L）100μL，制成LTG和CBZ濃度依次為1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0mg/L，OXC、PHT濃度依次為2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0mg/L的模擬血清樣品，按“2.3”方法處理并進(jìn)樣測(cè)定，以藥物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）對(duì)血清藥物濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。在選定色譜條件下，4種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍，見表1。

2．4．3 回收率：分別制備低（LTG 2.5mg/L，CBZ 2.5mg/L，OXC 5.0mg/L，PHT 5.0mg/L）、中（LTG 10.0mg/L，CBZ 10.0mg/L，OXC 20.0mg/L，PHT 20.0mg/L）、高（LTG 30.0mg/L，CBZ30.0mg/L，OXC60.0mg/L，PHT 60.0mg/L）3種濃度的血清模擬生物樣品，按“2.3”方法處理并進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得藥物峰面積（S血清＋藥）及內(nèi)標(biāo)峰面積（S血清＋內(nèi)標(biāo)），并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得測(cè)得濃度（C測(cè)得）。另取等量的各種藥物、內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣，測(cè)得峰面積（S純藥）及（S純內(nèi)標(biāo)）。藥物提取回收率＝S血清＋藥/S純藥×100％。內(nèi)標(biāo)提取回收率＝S血清＋內(nèi)標(biāo)/S純內(nèi)標(biāo)×100％。方法回收率＝C測(cè)得/C實(shí)際×100％。內(nèi)標(biāo)的提取回收率為94.49，4種藥物的提取回收結(jié)果及方法回收率結(jié)果，見表2。

2．4．4 精密度：分別配制低、中、高3種濃度的血清模擬樣品，按“2.3”方法處理并測(cè)定，日內(nèi)連續(xù)處理并測(cè)定5組，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)5d處理并測(cè)定，計(jì)算日間精密度。見表2。

2．4．5 穩(wěn)定性試驗(yàn)：制備低、中、高3種濃度血清模擬樣品，分別考察－40℃冰箱放置5d穩(wěn)定性、反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性和處理樣品室溫放置4h穩(wěn)定性。結(jié)果血清樣品低溫保存穩(wěn)定性、反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性和處理樣品室溫放置4h穩(wěn)定性良好，被測(cè)化合物的RSD＜10％。見表3。

表1 回歸方程與線性范圍Table 1 Regression equations and calibration range

表2 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery and precision test（n＝5）

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of stability test（n＝5）

5.0 2.6 3.9 3.2 1.9 4.1 6.8 OXC 20.0 2.2 4.6 4.7 2.4－2.6 7.3 60.0－1.3 2.5－3.1 5.6 4.6 3.1 5.0 2.8 4.3－1.4 1.9－3.7 5.8 PHT 20.0 4.1 5.2 2.7 4.2 4.6 3.3 60.0 1.8 1.8 3.9 3.4 1.9 4.9 2.5 2.8 7.6 2.8 1.7 3.2 2.5 CBZ 10.0 3.4 7.3－1.2 6.1－1.9 5.3 30.0 2.9 4.4 3.3 5.8 2.7 2.8

2．5 臨床應(yīng)用：本法已用于臨床患者血清中藥物濃度的測(cè)定，典型色譜圖見圖1。

3 討 論

文獻(xiàn)中選用的檢測(cè)波長(zhǎng)范圍較廣，多在205～245nm之間［1－10］。為保證實(shí)驗(yàn)條件最佳，在190～400nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)LTG、OXC、PHT和CBZ分別在221、223、238、221nm波長(zhǎng)處有最大吸收，為減少內(nèi)源性雜質(zhì)和溶劑峰的干擾，經(jīng)比較，選擇225nm為檢測(cè)波長(zhǎng)最為理想。

文獻(xiàn)中選擇的內(nèi)標(biāo)有阿普唑侖［4］、巴比妥［5］、莫沙必利［7］、氟西泮［8］等。最終確定選擇巴比妥作為內(nèi)標(biāo)，廉價(jià)易得，與4種抗癲癇藥物的結(jié)構(gòu)較類似，在選定的檢測(cè)波長(zhǎng)225nm下有較強(qiáng)吸收，在色譜圖上與LTG、OXC、PHT和CBZ分離良好。

文獻(xiàn)中多采用甲醇－水（接近50∶50，V/V）作為流動(dòng)相［2－6］，但在此條件下，4種藥物的保留時(shí)間過長(zhǎng)。因此，我們對(duì)流動(dòng)相做了調(diào)整，加入少量乙腈，減少甲醇比例，試用甲醇－乙腈－水（40∶10∶50，V/V/V）流動(dòng)相，在此條件下，各個(gè)藥物出峰時(shí)間均提前，但PHT與CBZ的分離度較差。最終確定甲醇－乙腈－水（39∶10∶51，V/V/V）的流動(dòng)相，可在12min內(nèi)完成對(duì)4種抗癲癇藥物的測(cè)定，且分離度較好。另外，部分研究中流動(dòng)相使用了磷酸鹽［7－9］，對(duì)儀器損害較大。而本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相中，未使用難沖洗且易損耗儀器的緩沖鹽類，分析結(jié)束后也無需進(jìn)行繁瑣和長(zhǎng)時(shí)間的沖洗，從而大大地延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命。

本實(shí)驗(yàn)以巴比妥為內(nèi)標(biāo)，建立了同時(shí)測(cè)定血清中LTG、OXC、PHT以及CBZ的反相高效液相色譜法，對(duì)藥物血清樣品低、中、高3種濃度進(jìn)行日內(nèi)、日間精密度的測(cè)定，日內(nèi)、日間精密度RSD均小于10％。本方法操作簡(jiǎn)便，精密度好，回收率高，雜質(zhì)干擾少，而且4種藥物與內(nèi)標(biāo)分離良好，能夠廣泛應(yīng)用，為臨床抗癲癇藥物血藥濃度監(jiān)測(cè)及臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究了提供了參考依據(jù)。

［1］付成效，畢津蓮，李湘斌，等.單步萃取-HPLC法同時(shí)測(cè)定人血清中3種抗癲癇藥濃度［J］.中國藥房，2011，22（2）：139－141.

［2］謝軍平，馮玲玲，楊瑞玲.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定茶堿與和3種抗癲癇藥血藥濃度［J］.藥物研究，2011，20（2）：22－24.

［3］徐玫，趙輝，萬紹輝，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定苯巴比妥、苯妥英鈉及卡馬西平的血藥濃度［J］.河南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2004，23（4）：40－42.

［4］李允武，金芝貴，吳飛華，等.用HPLC法快速測(cè)定多種抗癲癇藥物的血藥濃度［J］.藥學(xué)服務(wù)與研究，2006，6（3）：208－211.

［5］湯文璐，王永銘，伍章保，等.RP-HPLC同時(shí)測(cè)定人血清中苯巴比妥、苯妥英、卡馬西平的濃度［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2003，30（1）：71－73.

［6］杜青云，陳錦珊，黃惠麗.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定三種常用抗癲癇藥血清濃度［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，20（5）：334－336.

［7］余勤，梁茂植，趙焱，等.RP-HPLC同時(shí)測(cè)定血漿中苯巴比妥、苯妥英、卡馬西平和氫化可的松的濃度［J］.華西藥學(xué)雜志，2004，19（5）：357－359.

［8］劉穎，王麗，何大可.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定卡馬西平、拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英鈉及環(huán)氧卡馬西平的血清濃度［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10（8）：846－851.

［9］孫增先，周金玉，張騫峰，等.反相高效液相色譜法快速測(cè)定3種抗癲癇藥物血藥濃度［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2004，21（4）：316－318.

［10］楊潔，焦正，施孝金.人血漿中苯巴比妥、拉莫三嗪、奧卡西平及其單羥基代謝物的HPLC測(cè)定［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2006，37（6）：415－417.

（本文編輯：劉斯靜）

SIMULTANEOUSDETERM INATION OF SERUM CONCENTRATIONS
OF FOUR ANTIEPILEPTIC DRUGS BY RP-HPLC

ZHOU Chunhua，ZHANG Zhiqing*，ZHU Huimei
（Department of Pharmacy，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

Objective To establish a method for the determining of serum concentrations of Lamotrigine，Oxcarbazepine，Phenytoinum Natricum and Carbamazepine by reverse phase high performance liquid chromatography（RP-HPLC）.MethodsThe analytical column was Diamonsil C18 column（150 mm×4.6 mm，5μm）.Barbitone was used as the internal standard.The mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-water（39∶10∶51，V/V/V）at the flow rate of 1.0mL/min.The detection wavelength was set at 225nm and the column temperature was set at 25℃.ResultsThe antiepileptic drugs（Lamotrigine，Oxcarbazepin，Phenytoinum Natricum and Carbamazepine）were separated well under the chromatography conditions.The standard curvilinear equation of Lamotriginewas Y＝0.155 1X＋0.096 3（r＝0.999 1）with a linear range of1.00－40.00mg/L，the standard curvilinear equation of Oxcarbazepine was Y＝0.121 7X＋0.179 7（r＝0.999 0）with a linear range of 2.00－80.00mg/L，the standard curvilinear equation of Phenytoinum Natricum was Y＝0.063 4X＋0.078 2（r＝0.999 3）with a linear range of 2.00－80.00mg/L and the standard curvilinear equation of Carbamazepin was Y＝0.210 9X＋0.017 0（r＝0.999 8）with a linear range of 1.00－40.00mg/L，respectively.The mean relative recovery of Lamotrigine，Oxcarbazepine，Phenytoinum Natricum and Carbamazepine werewithin 90.5％－105.8％.The intra-day and the inter-day RSD were less than 10％.

chromatography，high pressure liquid；anticonvulsants；plasma concentration

R969.1

A

1007-3205（2013）05-0552-04

2013－01－25；

2013－03－05

周春華（1980－），男，河北唐山人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥師，醫(yī)學(xué)碩士，從事藥動(dòng)學(xué)及臨床藥學(xué)研究。

*通訊作者。E-mail：zhangzhq＠m(xù)edmail.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.05.020

The serum samples were stable when stored at－40℃for 5 days or freeze-thaw for thrice and the processed sampleswere stable within 4h.ConclusionThismethod is convenient，economic，rapid and accurate without interfering with each other，which is suitable for the blood concentration monitoring of therapeutic drugs.