旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織Casepase-3表達影響

王英杰，王文勝，蘇軍紅，柴錫慶，3*，劉志軍

（1.河北省邯鄲市第一醫院神經內科，河北邯鄲056002；2.河北醫科大學基礎醫學研究所省部共建教育部重點實驗室，河北石家莊050017；3.河北化工醫藥職業技術學院新藥研發基地，河北石家莊050026）

·論 著·

旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織Casepase-3表達影響

王英杰1，2，王文勝2，蘇軍紅1，柴錫慶2，3*，劉志軍1

（1.河北省邯鄲市第一醫院神經內科，河北邯鄲056002；2.河北醫科大學基礎醫學研究所省部共建教育部重點實驗室，河北石家莊050017；3.河北化工醫藥職業技術學院新藥研發基地，河北石家莊050026）

目的觀察旋覆花素對β-淀粉樣蛋白25～35片段（β-amyloid protein 25～35，Aβ25～35）海馬內注射所致阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）模型大鼠海馬Caspase-3表達的影響，探討其對AD大鼠的治療作用及機制。方法30只SD大鼠隨機分為對照組、模型組及給藥組，Aβ25～35海馬內注射制備AD大鼠模型，給藥組給予旋覆花素26mg·kg－1·d－1、模型組給予等量溶劑，分2次灌胃，共21d。免疫組織化學及Western blot測定大鼠海馬Caspase-3表達。結果模型組海馬Caspase-3表達升高，給藥組Caspase-3表達下降，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論旋覆花素主要通過抑制Caspase-3的表達，從而抑制Aβ誘導的AD模型大鼠腦海馬的神經細胞凋亡。

阿爾茨海默病；淀粉樣β-蛋白；旋覆花素；大鼠

細胞凋亡是貫穿于機體生命過程始終、普遍存在的一種由基因活動指導下的細胞主動性死亡現象。生理情況參與調節體內正常細胞的更新和異常細胞的清除，對于確保細胞增殖與更新之間的平衡、維持細胞數量的穩定起重要作用［1］。神經細胞凋亡是阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）等退行性疾病發展過程中的重要事件［2－4］，凋亡的神經細胞是不可逆的，但處于凋亡過程中的神經細胞存在

不同程度的可逆性。本研究觀察旋覆花素對β-淀粉樣蛋白25～35片段（β-amyloid protein 25～35，Aβ25～35）海馬內注射誘導的AD模型大鼠腦海馬組織凋亡相關基因變化的影響，旨在從凋亡角度闡明旋覆花素對AD的防治作用及其機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物：健康雄性SD大鼠30只（由河北省實驗動物中心提供，動物合格證號611071），10～12月齡，體質量（364.5±15.0）g，隨機分為3組，對照組、模型組和給藥組，每組10只。給藥組術前3d及術后每天用旋覆花素26mg·kg－1·d－1灌胃，共21 d。模型組用旋覆花素的溶劑吐溫80水溶液同法處理。

1．2 試劑與儀器：旋覆花素由河北醫科大學藥學院從歐亞旋覆花的氯仿提取物中分離制備（已獲專利授權），含旋覆花內酶2.66g/L。Aβ25～35購自Sigma公司；Casepase-3抗體購自Santa Cruz公司；免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司；腦立體定向儀由上海川沙花木農機廠制造。

1．3 Aβ25～35的孵育：用無菌生理鹽水將Aβ25～35稀釋成10g/L，37℃孵育72h，使其變為聚集狀態的Aβ25～35，置于4℃冰箱備用。

1．4 藥物海馬內注射：大鼠用質量濃度為20g/L烏拉坦60mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定向儀上。參照大鼠腦立體定位圖譜［2］，以前囟為零點，于前囟后3.5mm，中線右側旁開2mm，為穿刺點，用牙科鉆鉆開顱骨，以微量注射器自腦表面垂直進針3mm，分別在雙側海馬CA1區于5min內緩慢注射Aβ25～35各1μL（10μg），留針5min，對照組注射等量的生理鹽水，退針縫合切口。術前3d及術后18d，給藥組給予旋覆花素26mg·kg－1·d－1，分2次灌胃，模型組給予等量溶劑。

1．5 免疫組織化學染色：參照使用說明書進行乙醇梯度脫水，石蠟垂直包埋，間斷均勻切片，切片厚約10μm，采用鏈霉親和素－生物素復合素方法進行免疫組織化學染色。以抗Caspase-3（1∶100）抗體為一抗，其他操作按試劑盒說明書進行。以鏡下出現棕黃色顆粒作為判定陽性染色的標準。用PBS替代一抗作為陰性對照。

1．6 Western blot分析：各組取等量蛋白提取液100μg，經12％聚丙烯酰胺凝胺電泳分離后，于半干轉膜儀上轉移至聚偏二氟乙烯膜，用5％的脫脂奶粉封閉，與抗Casepase-3抗體（1∶400）在4℃條件下反應過夜。然后與辣根過氧化物酶標記的相應二抗（1∶10 000）室溫反應2h，室溫條件下用TTBS、TBS充分振蕩洗膜后采用化學發光法顯影。用美國Kodak公司ID數碼成像分析系統分析結果。

1．7 統計學方法：應用SPSS13.0統計軟件包進行數據，計量資料以±s表示，多樣本均數采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

免疫組織化學染色結果顯示，模型組大鼠腦海馬組織中Casepase-3表達較對照組明顯增強，染色細胞數量多，著色深；給藥組大鼠腦海馬組織Casepase-3的表達明顯較模型組減弱，染色細胞數量少，著色變淺。見圖1。Western blot結果顯示，模型組大鼠腦海馬組織Casepase-3表達較對照組大鼠顯著增強；給藥組大鼠腦海馬組織Casepase-3表達較模型組明顯減弱（P＜0.05）。見圖2。說明旋覆花素能抑制Aβ25～35誘導的AD模型大鼠腦海馬組織的Casepase-3基因的表達。

圖1 大鼠海馬CA1區Casepase-3免疫組織化學染色（×400）A.對照組；B.模型組；C.給藥組Figure 1 Immunostaining analysis of casepase-3 in hippocampus（×400）A.Control group；B.Model group；C.Treatment group

圖2 旋覆花素抑制海馬組織Casepase-3蛋白表達A.Western blot檢測海馬組織Casepase-3表達（n＝4）；B.Casepase-3蛋白條帶分析（n＝4）*P＜0.05與其他2組比較（方差分析）Figure 2 The inhibition of casepase-3 expression by inulicinA.Protein isolated from hippocampus of control，model，and treatment rats was analyzed for casepase-3 expression by Western blot（n＝4）；B. Relative level of casepase-3（n＝4）*P＜0.05 vs other group by one way ANOVA

3 討 論

凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自然死亡的過程，最后細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，被其他細胞吞噬。處于凋亡過程中的神經細胞存在不同程度的可逆性。因此，采取措施抑制凋亡途徑的級聯反應，可能會為延長AD患者神經細胞的存活提供希望。

觸發凋亡的途徑很多［5－6］，但最終均會通過半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶級聯反應，Caspase-3的活化被視作廣泛神經細胞凋亡的一個主要機制［7－9］。目前認為Caspase可能通過分解凋亡保護蛋白Bcl-2家族成員、分解核層的中間絲致使堅固的核層結構解體，導致核膜破壞及染色體濃縮，使細胞內一些參與DNA修復的酶失活，令細胞喪失修復功能，誘導細胞凋亡。通過細胞死亡信號通路，Aβ可與多種受體相互作用生成Casepase。產生自由基的高級糖基化終末產物受體、誘導凋亡的淀粉樣前體蛋白和p75神經營養受體介導了Casepase的生成，活化的Casepase導致AD神經細胞凋亡［10－11］。

本研究結果顯示，給藥組大鼠腦海馬組織Caspase-3表達較模型組明顯降低。提示旋覆花素可能是通過抑制Caspase-3表達，減輕神經細胞的凋亡。

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（本文編輯：趙麗潔）

EFFECT OF INULICIN ON EXPRESSION OF CASEPASE-3 IN AD MODEL RATS HIPPOCAMPUS

WANG Yingjie1，2，WANGWensheng2，SU Junhong1，CHAIXiqing2，3*，LIU Zhijun1
（1．Department of Neurology，the First Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056002，China；2．Key Laboratory by Province and Education Ministry，Institute of Basic Medicine，HebeiMedical University，Hebei Province，Shijiazhuang 050017，China；3．Department of New Drugs Research and Discovery，Hebei
Chemical Pharmaceutical College，Hebei Province，Shijiazhuang 050026，China）

Objective To explore themolecularmechanism of inulicin in rats with Alzheimers disease（AD）.MethodsSprague-Dawley（SD）ratsweighing of（364.5±15.0）g weremicroinjected withβ-amyloid protein 25－35（Aβ25－35）into the hippocampus to induce AD model rats.In inulicin treatment group，the animals were pretreated with inulicin（contain 1-o-acetylbritannilactone 2.66g/L）dissolved in tween-80 3 days before operation，then inulicin was administered to rats at dose of ABL 26mg· kg－1·d－1by gastric gavage orally for 21 days（n＝10）.The casepase-3 protein in hippocampus was detected by immunohistochemistry and western blot.MethodsCasepase-3 expression wasmore intensive in hippocampus cell of model rats than that of control rats（P＜0.05），but there was no significant difference between innulicin-treated and control rats（P＞0.05）.ConclusionInulicin could inhibit the apoptosis by Aβinjection into hippocampus by down-regulating casepase-3 expression.

alzheimers disease；amyloid beta-protein；innulicin；rats

R742

A

1007-3205（2013）05-0501-03

2012－11－08；

2012－12－05

王英杰（1973－），男，河北邯鄲人，河北省邯鄲市第一醫院副主任醫師，醫學博士，從事老年癡呆診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.05.002