靜態注射化學發光法測定黃芩苷含量

張亞莉，李景印，哈婧，李玉佩，王未肖

（1.河北科技大學 理學院，河北 石家莊 050018；2.河北科技大學 化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018）

黃芩苷（baicalin，C21H18O11）屬于多酚羥基的黃酮類化合物，是中藥黃芩的主要有效成分和質量控制指標.具有抗菌消炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等生物活性［1－4］，還能對早期腎功能損傷和急性肝損傷起到保護作用［5－6］，以及吸收紫外線、清除氧自由基、抑制黑色素的生成等作用.因此對黃芩苷測定方法的研究具有重要的意義.目前常用的黃芩苷測定方法有高效液相色譜法及色質聯用［7－10］、毛細管電泳［11］、光譜法［12－13］、薄層色譜法［14］及X線衍射分析方法［15］，但這些方法的檢出限都較低.化學發光分析技術法由于其儀器裝置簡單、靈敏度高、操作快速等特點已被廣泛應用在環境、食品、藥物及免疫分析等許多分析科學領域［16］.本實驗采用靜態注射化學發光法，利用黃芩苷對堿性條件下魯米諾和雙氧水化學發光體系的抑制作用，建立了中草藥黃芩中黃芩苷含量的檢測方法，并將測定結果與高效液相色譜法測定結果進行對比，結果一致.

1 實驗部分

1.1 主要原料

魯米諾（SigmaA8511）：北京拜爾迪生物公司；黃芩苷標準品：中國食品藥品檢定院；體積分數30%過氧化氫（H2O2）：天津市恒興化學試劑制造有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市百世化工有限公司；氫氧化鈉（分析純）：北京精細化學品有限責任公司.魯米諾溶于0.1mol／L NaOH配制成2×10－2mol／L儲備液，置于冰箱冷藏，實驗時用0.1mol／L NaOH溶液稀釋至合適濃度.黃芩苷溶于體積分數60%乙醇配制成1×10－3mol／L儲備液，置于冰箱冷藏，實驗時用二次蒸餾水稀釋至合適濃度.實驗用水均為二次蒸餾水.

1.2 主要設備

BPCL型化學發光儀（中國科學院生物物理研究所）；高效液相色譜儀（AgilentTechnologies 1200Series）：安捷倫科技有限公司；電子天平（AL204）：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；石英自動雙重純水蒸餾器：江蘇省金壇市富華有限公司；微型植物試樣粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司.

1.3 實驗步驟

在1.5mL塑料離心管中將黃芩苷標準品儲備液（或待測樣品，空白實驗用體積分數60%乙醇，實驗表明乙醇對化學發光信號也有一定的抑制作用）用二次蒸餾水稀釋至合適濃度，用可調微量進樣器吸取50μL試液和40μL魯米諾的堿性（氫氧化鈉濃度為0.016mol／L）溶液加入發光池，置于發光儀測量室中，打開光門，用進樣器向發光池中加入40μL的H2O2溶液，用化學發光儀測定發光強度，發光池每次用完用蒸餾水沖洗2遍以減少隨機誤差.化學發光儀負高壓為500V.

2 結果與討論

2.1 化學發光條件的選擇

2.1.1 化學發光反應的動力學性質

圖1中給出了室溫下該實驗的化學發光反應動力學曲線.其中曲線1表示luminol－H2O2－NaOH體系的化學發光曲線，曲線2表示加入黃芩苷后luminol－H2O2－NaOH體系的化學發光曲線.由圖可見：1）由進樣器注入H2O2溶液后4s發光強度達到最大值，隨后迅速降低，說明該化學發光體系是快發光反應.2）黃芩苷對該發光體系有明顯的抑制作用.

2.1.2 Luminol濃度的影響

實驗了魯米諾不同濃度下的化學發光強度（luminol－H2O2，luminol－H2O2－乙醇，luminol－H2O2－黃芩苷）.結果如圖2所示，以樣品抑制發光強度與空白抑制發光強度的比（以下同）對luminol的濃度進行作圖，在濃度1×10－5～8×10－4mol／L，比值隨著魯米諾濃度的增加而增加，在魯米諾濃度為5×10－5mol／L時達到最大，此后相對發光強度的比值逐漸減小，因此本實驗選擇的魯米諾濃度為5×10－5mol／L.

2.1.3 氫氧化鈉濃度的影響（堿性條件）

魯米諾的氧化發光反應需在堿性介質中進行，堿性條件對luminol－H2O2化學發光強度有顯著的影響.實驗發現隨著NaOH濃度的增加，樣品和空白的相對發光強度明顯增強，相對發光強度比值在NaOH濃度為0.016mol／L達到最大而后逐漸降低（圖3），因此本實驗選擇的 NaOH 濃度為0.016mol／L（pH＝12.2）.

2.1.4 H2O2濃度的影響

實驗了不同濃度的H2O2對相對發光強度的影響.結果如圖4所示，在0.01～0.06mol／L內，相對發光強度在H2O2濃度為0.03mol／L時達到最大而后減小，因此本實驗選擇的H2O2濃度為0.03mol／L.

2.2 線性范圍、精密度和檢出限

在選定的最佳實驗條件下對黃芩苷進行測定，黃芩苷濃度在1×10－8～3×10－7mol／L內呈良好的線性關系，線性方程為ΔI＝41.03c＋74.66（其中，ΔI為體系抑制的發光強度，c為黃芩苷的濃度（10－7mol／L）），線性相關系數為0.996 3.檢出限為2.93×10－9mol／L（以最小檢測濃度5.0×10－9mol／L計算，11次空白的相對標準偏差是2.5%）；對濃度為3×10－8mol／L的黃芩苷平行測定11次，計算其相對標準偏差（RSD）為2.3%，滿足分析測定要求.

2.3 干擾測定

在選定的最佳實驗條件下，以2×10－7mol／L的黃芩苷進行干擾測定，考察了幾種離子對黃芩苷測定的影響.結果表明，當相對誤差≤ ±5% 時允許共存的物質有PO3－4，可溶性淀粉、葡萄糖（1 000倍）；20倍的Fe3＋基本沒有干擾，但隨著Fe3＋濃度的增大其對體系會有增強作用，影響黃芩苷含量的測定；Cu2＋對本體系發光強度具有明顯的增強作用.

2.4 樣品的提取與檢測及回收率測定

將購買的4份中草藥黃芩樣品（河北、山西各2份）于80℃干燥至恒重，粉碎過孔徑0.25mm篩得待測樣品.用分析天平稱取待測樣品1g于圓底燒瓶中，加入45mL 60%乙醇溶劑，加熱回流1.5h，將回流液倒入錐形瓶中；再次向圓底燒瓶加入45mL體積分數60%乙醇溶劑，回流1.5h，合并2次回流液，用少量溶劑洗滌圓底燒瓶和殘渣，洗滌液合并入回流液，過濾，濾液置于100mL容量瓶中，補加溶劑至刻度，搖勻.

按本實驗選定的最佳實驗條件測定樣品中黃芩苷的含量，結果如表1，并與高效液相色譜法測定結果（面積歸一法）進行對比，結果比較滿意.另選取山西2樣品在其中分別加入一定量的黃芩苷標準品進行回收率實驗，結果如表2，準確度良好.

表1 4種黃芩樣品中黃芩苷含量的測定Tab.1 Determination results of baicalin in scutellaria

表2 回收率測定Tab.2 Recovery test

3 結論

基于黃芩苷對魯米諾－過氧化氫－氫氧化鈉化學發光體系具有強抑制作用，建立了中草藥黃芩中黃芩苷含量的檢測方法，該方法靈敏度高，線性范圍寬，操作簡便.能滿足快速分析的要求.

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