華北八寶組織培養與再生體系的建立

張璐，王俊麗，王玨，田璧瑞，馬林喜

（中央民族大學生命與環境科學學院，北京 100081）

華北八寶（Hylotelephiumtatarinowii（Maxim.）H.Ohba），又稱華北景天，是景天科八寶屬的多年生草本植物.花期7～8月，果期9月.分布于內蒙古、河北、山西等地，生于海拔1 000～3 000m處山地石縫中.常見于向陽山石上［1］.

華北八寶屬于中國的名貴香草植物，可用于精油香料的提取、疾病的防治等［2］.該植物為多肉多漿耐旱花卉，株型小巧，花朵繁茂，可作為耐旱盆栽花卉用于城市園林綠化，并且已被錄入中國第6批植物新品種保護名錄［3－4］.

根據文獻報道，八寶屬植物大多具有藥用價值，例如，八寶、輪葉八寶、珠芽八寶、白八寶、狹穗八寶、紫花八寶［5－6］等植物具有祛風清熱、散瘀消腫、消炎止血等功效.由于華北八寶分布海拔較高，在低海拔地區繁殖難度大，目前可利用的野生資源較少.為了進一步擴大種源，可以采用組織培養的方法，建立華北八寶的快速高效再生體系.目前已有多種植物通過組織培養技術建立了其再生體系，如半夏［7］、新疆雪蓮［8］、胭脂花［9］等.

本研究的目的在于以野生華北八寶植株為材料，建立組織培養再生體系，為華北八寶的進一步開發利用奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 植物材料的選取與消毒處理

華北八寶野生植株采自北京靈山海拔2 300m的石縫間.選取其幼嫩葉片作為外植體，將幼嫩葉片小心取下，用洗滌靈清洗干凈之后在流水下沖洗2h，用體積分數為70%的酒精浸泡30s，再浸于質量分數為0.1%的HgCl2中（加吐溫2滴）消毒12min，用無菌水沖洗3～4次.

1.2 培養基及培養方法

以MS培養基為基本培養基，添加質量分數為3%的蔗糖和1%的瓊脂粉（pH 5.8），121℃高壓滅菌20min.

1.2.1 愈傷組織的誘導

在MS培養基中分別加入不同質量濃度的2，4－D（0，0.5，1.0，2.0，4.0mg／L）與6－BA（0，0.5，1.0，2.0mg／L）2種植物生長調節劑，以幼嫩葉片為外植體進行愈傷組織的誘導.

將消毒后的幼嫩葉片切成0.3cm×0.5cm的小塊，并用刀片在葉面上刻傷，接種于已經過121℃高壓滅菌20min后的培養基中，每瓶接種7塊，9瓶為一個處理，重復3次，30d后觀察統計愈傷組織誘導率.

1.2.2 不定芽的分化誘導

以MS為基本培養基，加入不同質量濃度的6－BA（0，0.5，1.0，2.0，4.0mg／L），TDZ（0，0.5，1.0，2.0，4.0mg／L），NAA（0，0.5，1.0，2.0，4.0mg／L），以生長旺盛的愈傷組織為材料進行不定芽的分化誘導.

將愈傷組織切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊，每瓶接種7塊，9瓶為一個處理，重復3次，30d后觀察統計不定芽誘導率.

1.2.3 生根培養

分別在MS，1／2MS 2種培養基中進行生根培養.將長到2～3cm的不定芽取出，接于增殖培養基6－BA 1.0mg／L中.20d后將長到3～4cm的不定芽接于生根培養基中，每瓶接種數為6個，9瓶為一個處理，重復3次，30d后觀察統計生根率.

1.2.4 煉苗與移栽

選取已生根且植株健壯的再生苗，移栽前先打開瓶蓋，在散射光條件下煉苗3d，之后用鑷子輕輕取出幼苗，先將幼苗根部的培養基用清水沖洗干凈，然后將幼苗移栽到珍珠巖∶營養土∶蛭石＝1∶2∶1（體積比）的培養土中.移栽后澆透水，之后保持適當的溫度、濕度和光照.移栽15d后統計成活率.

1.2.5 培養條件

培養室溫度為（25±2）℃，光照時間為12h／d，光照強度為40μmol／（m2·s）.

2 結果與分析

2.1 愈傷組織的誘導

研究發現，培養基中添加單一植物生長調節劑時，愈傷組織的誘導效果均不好.當2，4－D質量濃度為2.0mg／L時誘導率最高為23.81%（表1）；6－BA質量濃度為1.0mg／L時誘導率最高為12.56%（表2）.在含有不同質量濃度2，4－D和6－BA組合的培養基中愈傷組織誘導率較高，以培養基MS＋2，4－D 2.0mg／L＋6－BA 0.5mg／L中的愈傷組織誘導率最高，達到了92.06%（表3），并且愈傷組織狀態良好，黃綠色較疏松，生長旺盛（圖1）.

表1 2，4－D對華北八寶愈傷組織誘導率的影響Tab.1 Effect of 2，4－D on induction rates of the callus of Hylotelephium tatarinowii

表2 6－BA對華北八寶愈傷組織誘導率的影響Tab.2 Effect of 6－BA on induction rates of the callus of Hylotelephium tatarinowii

數據以±s表示，P＜0.05，標有相同字母的數據表示差異不顯著，標有不同字母的數據表示差異顯著.

表3 6－BA和2，4－D組合對愈傷組織誘導率的影響Tab.3 Effects of different mass concentrations of 6－BA and 2，4－D on callus induction rates

圖1 2，4－D與6－BA配合對葉片愈傷組織的誘導效應Fig.1 Effects of 2，4－D in combination with 6－BA on callus induction

2.2 不定芽的誘導

2.2.1 TDZ與6－BA組合對不定芽分化的影響

在含有不同質量濃度的TDZ或不同質量濃度配比的TDZ與6－BA組合的不定芽誘導培養基中，均未有不定芽的分化，部分愈傷組織呈現嫩綠色且有所增殖，部分愈傷組織褐化或死亡.因此這類培養基組合不適合華北八寶不定芽的分化培養.

2.2.2 TDZ與NAA組合對不定芽分化的影響

在含有不同質量濃度配比的TDZ與NAA的不定芽誘導培養基中，也均未有不定芽的分化，且未分化的愈傷組織部分褐變或死亡.因此這類培養基組合同樣不適合華北八寶不定芽的分化培養.

2.2.3 6－BA與NAA組合對不定芽分化的影響

在含有不同質量濃度的6－BA或不同質量濃度配比的6－BA與NAA組合的不定芽誘導培養基中，均有不定芽的分化.愈傷組織在接入含6－BA與NAA的不定芽誘導培養基后，10d內體積有所增大，顏色加深，15d后開始出現綠色小突起，20～25d時，部分愈傷組織開始叢生不定芽（圖2）.在MS＋6－BA 1.0mg／L培養基中不定芽的誘導率最高，達到81.52%（表4）.

圖2 愈傷組織分化不定芽Fig.2 Adventitious bud induced from callus

表4 愈傷組織不定芽誘導率Tab.4 Adventitious bud induction rates

2.3 生根培養

不定芽在MS和1／2MS 2種培養基中進行誘導培養，10d后，開始生出白色細根，最長可達到3～4cm，成輻射狀分布.培養30d后，2種培養基的生根率均可達到100%.1／2MS培養基中每個植株的平均根條數可達到5.9條，而MS培養基中的平均根條數為4.0條（圖3）.

圖3 再生苗Fig.3 Regenerated plants

2.4 煉苗與移栽

生根苗煉苗移栽后，植株生長良好，15d后統計，移栽成活率可達95%以上.

3 討論

本研究發現，在培養基中單獨附加2，4－D或6－BA，對愈傷組織的誘導效果均不顯著，而質量濃度低于4.0mg／L的2，4－D和6－BA配合使用時，愈傷組織的誘導率明顯提高.在加入2，4－D和6－BA不同質量濃度組合的培養基中，若2，4－D質量濃度低于6－BA或與之相同時，葉片膨大表現得較為明顯，并且誘導出的愈傷組織為深綠色且較致密.而在2，4－D質量濃度高于6－BA質量濃度時，葉片膨大現象不明顯，誘導出的愈傷組織為淺黃綠色且較疏松.較高質量濃度的2，4－D（4.0mg／L）不利于愈傷組織的誘導.MS＋2，4－D 2.0mg／L＋6－BA 0.5mg／L培養基的愈傷組織誘導率最高，達到了92.06%.王俊麗等［10］在對華北大黃愈傷組織誘導研究中發現，當不同質量濃度的6－BA分別與低質量濃度2，4－D配合使用時，對愈傷組織的增殖效應十分明顯，其中MS＋6－BA 2.0mg／L＋2，4－D 0.2mg／L培養基的增殖效果較好，這與本研究的結果不盡相同.

此外，本研究還發現，6－BA是影響不定芽分化的關鍵因素，在培養基中單獨添加不同質量濃度的6－BA或不同質量濃度配比的6－BA與NAA組合，均可誘導不定芽的分化.這與文獻所報道的細胞分裂素對組織培養中不定芽的分化及增殖有著顯著作用結論［11－12］相一致.張曉艷等［13］研究了影響八寶景天愈傷組織誘導、芽誘導、生根的主要因素，發現八寶景天葉片切塊誘導愈傷組織的最佳培養基為MS＋6－BA 2.0mg／L＋NAA 1.0mg／L，誘導率達93.3%；MS＋6－BA 2mg／L＋NAA 0.1mg／L培養基有利于芽的分化和增殖.任爽英等［14］研究也發現，培養基中添加6－BA時對八寶景天不定芽的分化有促進作用.上述研究與本研究結果相一致.

本研究以華北八寶幼嫩葉片為外植體建立了其組織培養再生體系，這對野生華北八寶的開發與利用有著重要意義.

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