ELISA兩步夾心法測定HBsAg在獻血篩查中的應用

何星，洪茂，黃小明

(1、金華市中心血站，浙江金華321000;2、上海市第一人民醫院寶山分院檢驗科，上海寶山200940;3、金華市第五醫院，浙江金華321000)

ELISA兩步夾心法測定HBsAg在獻血篩查中的應用

何星1，洪茂2，黃小明3

(1、金華市中心血站，浙江金華321000;2、上海市第一人民醫院寶山分院檢驗科，上海寶山200940;3、金華市第五醫院，浙江金華321000)

目的評價無償獻血標本用ELISA兩步法檢測HBsAg模式應用的效果。方法對膠體金法篩查陰性無償獻血者標本45477份，采用ELISA一步法和兩步法進一步復核對比分析。結果膠體金法均為陰性標本中，ELISA一步法282例HBsAg呈陽性，陽性率為0.62%；ELISA兩步法586例HBsAg呈陽性，陽性率為1.29%,兩種方法檢測結果的差異具有統計學意義(P＜0.01)。結論應用ELISA兩步夾心法對獻血者HBsAg實施檢測對降低HBsAg漏檢率具有重要的意義。

無償獻血;HBsAg;ELISA;兩步法

我國是乙型肝炎高度流行區，乙肝表面抗原(HBsAg)攜帶者達7.18%[1]。為了保證安全輸血，獻血前應用膠體金法HBsAg的篩查，并用兩種不同試劑進行兩次ELISA方法的HBsAg檢測，是目前采供血機構對獻血者進行乙型肝炎表面抗原(HB-sAg)檢測的主要策略。由于“一步法”存在產生“后帶現象”的可能，為盡可能避免漏檢，《中國藥典》2010年版中取消一步法，僅收錄二步法。我們用ELISA兩步夾心法方法和一步法分別對我血站45477名獻血員進行HBsAg感染檢測，并分析這兩種方法在測定HBsAg結果上的差異，現報告結果如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源2010年6月至2011年5月本站無償獻血者血液標本45477份。獻血者獻血前，均常規使用HBsAg金標試紙條進行初篩，結果陰性者方可獻血。

1.2 試劑膠體金法HBsAg試劑為廈門英科新創公司產品。初檢試劑(“一步法”)HBsAg為廈門英科新創公司產品,復檢試劑(“兩步法”)HBsAg為雅培公司，以上三種試劑均經過中國藥品生物制品檢定所批批檢定，且在有效期內使用，操作嚴格按照說明書要求進行。

1.3 主要儀器Tecan Rsp150全自動加樣儀(瑞士TECAN公司)；BepⅢ全自動酶免分析系統(德國Bering公司)；Xantus全自動加樣儀(瑞士Sias公司)；FAME全自動酶免分析系統(瑞士HAMILTON

公司)；SUNRISE酶標儀(瑞士TECAN公司)； Columbus洗板機(瑞士TECAN公司)。

1.4 方法與結果判斷

1.4.1 酶免疫“一步法”檢測HBsAg原理，酶免疫“兩步法”檢測HBsAg原理[2]。

1.5 統計學方法SPSS17.0統計軟件，率的比較用χ2檢驗，兩均數比較用t檢驗，P＜0.05，為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二種方法檢測45477份獻血者的HBsAg結果情況一步法檢測HBsAg陽性為282份，陽性率為0.62%(282／45477)，二步法檢測HBsAg陽性為586份，陽性率為1.29%(586／45477)；在730份HBsAg陽性標本中，一步法的檢出率為38.63% (282／730)，二步法的檢出率為80.27%(586／730)。經統計學處理，兩種方法檢測結果差異有統計學意義(χ2=107.50，P＜0.01),見表1。

表1 45477份獻血者的血清標本ELlSA法檢測HBsAg結果[n(%)]

2.2 138份二種方法同時陽性標本的S/CO值情況當S/CO值在0.9～7.99時，經統計學處理，一步法和二步法檢測HBsAg檢測能力差異有統計學意義(t′=5.9693，P＜0.05)；當S/CO值≥8.0時，一步法和二步法檢測HBsAg檢測能力差異也有統計學意義。(t′=4.9581，P＜0.05)，見表2。

2.3 448份兩步法陽性一步法陰性標本處理結果情況對448份標本同時做HBeAg,HBeAb和HBcAb三項檢測，只要有一項有反應性記錄為陽性，共記420份；其他三項檢測均無反應性的28份。對420份有反應性的標本用一步法稀釋處理，檢測結果見表3。

表2 兩種方法均為陽性的138例標本S/CO值比較

表3 一步法檢測420份不同稀釋標本的HBsAg結果

3 討論

經過本次回顧性研究發現：所有獻血者都在獻血前用金標試紙條做了HBsAg初篩，因此大部分HBsAg攜帶者都被排除。但是受初篩試劑方法本身的限制，仍然有部分HBsAg陽性的標本被采集。本文收集從2010年6月到2011年5月對HBsAg進行檢測的數據，包括使用國產新創試劑一步法數據和同時用進口雅培試劑兩步法復檢數據。由表1可見HBsAg陽性率，一步法為0.62%，兩步法為1.29%，表明兩步法檢測水平明顯高于一步法。通過表2，對比二種方法同時陽性標本的S/ CO值，同一標本兩步法與一步法存在顯著差異，而且兩步法S/CO值普遍都要高，這也顯示兩步法比一步法檢測能力要強。通過表3分析得出，隨著稀釋倍數增加，一步法陽性檢出率逐步上升，漏檢率明顯下降。

筆者認為，一步法在檢測HBsAg時，很可能出現過量的抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，卻沒有形成“HBsAb-HBsAg-HBsAb-HRP”復合物，即產生“鉤狀效應”[3]，尤其是高濃度的HBsAg導致“后帶現象”，出現假低值，嚴重時可以造成假陰性。將這些標本進行適當倍數稀釋后可以有效消除鉤狀效應，這與有關文獻報道一致[4]。兩步法通過把游離抗原(未與固相抗體結合的多余抗原)洗掉，再加酶標抗體，因為結合抗原是多價的，所以形成“HBsAb-HBsAg-HBsAb-HRP”復合物，最后催化底物，呈現陽性結果，有利避開“后帶現象”(見表3)，而且不用稀釋樣本。至于28份HBeAg, HBeAb和HBcAb三項檢測均為陰性標本，由于不同試劑廠家針對乙型肝炎病毒DNA的S基因編碼的衣殼蛋白包被物差異或者其他不明原因造成。但是兩種試劑都存在一定漏檢率，因此同時使用兩種不同試劑來檢測對降低HBsAg漏檢率有重要意義，這也符合國標“采出的血液必須進行初檢和復檢的要求”規定。

綜上所述，此前ELISA一步夾心法靈敏度高，特異性好，耗時也不長久，因此得以廣泛應用。但是近幾年來相繼有報道ELISA一步夾心法檢測HBsAg也易出現假陰性結果[5]。作為經典的兩步法，與ELISA一步夾心法檢測HBsAg時對實驗條件要求基本相同，不需要特別儀器和專門技術培訓。筆者認為ELISA兩步夾心法敏感性更高，有利于避免產生高值鉤狀效應和縮短HBV感染的“窗口期”[6]。血站應篩查出部分處于窗口期或對受血者相對不安全的血液，進一步降低輸血風險。因此，在降低HBV傳播風險提高血液安全性方面，兩步法具有非常重要的意義，一步法與兩步法聯合使用，更能保證血液安全。

[1]衛生部疾病預防控制局,中國疾病預防控制中心.全國人群乙型病毒性肝炎血清流行病學調查報告[M].北京:人民衛生出版社, 2011:4.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(三部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:355.

[3]楊劍.ELISA一步法和兩步法檢測乙肝HBsAg的結果比較[J]實驗與檢驗醫學,2011,29(5):569.

[4]胡越,蔣瑞馨,邵家幼.兩種酶聯免疫吸附法檢測乙肝表面抗原的結果比較[J].實驗與檢驗醫學，2012，30(3):269-270.

[5]風倩,陶傳敏,嚴可明,等.ELISA一步夾心法檢測HBsAg假陰性原因分析.[J]華西醫學,2008,23(6):1394-1395.

[6]謝琳,易鳴,高命,等.ELISA一步夾心法檢測HBsAg假陰性的原因及對策分析[J].現代臨床醫學,2011,37(3):211-212.

R446.62,R512.6+2,R193.3

A

1674-1129(2013)05-0498-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.05.039

洪茂