PCR-SSP法在ABO疑難血型鑒定中的應用

肖莉，后平欽，李國良

(江西省血液中心,江西南昌330077)

PCR-SSP法在ABO疑難血型鑒定中的應用

肖莉，后平欽，李國良

(江西省血液中心,江西南昌330077)

目的采用PCR-SSP法檢測ABO基因型。方法ABO血型血清學正反定型不符樣本10個，用PCR-SSP法檢測其基因型。結果10個疑難血型標本PCR-SSP法均得出明確的ABO血型結果。結論PCR-SSP法檢測ABO血型方法可靠，可應用于臨床輸血。

ABO血型；ABO血型基因型；PCR-SSP

1900年由Landsteiner發現的ABO血型系統在臨床輸血中具有極其重要的意義。ABO血型的標準血清學正反定型方法，因具有簡單實用的特點而得到推廣和普及，但血清學試驗亦存在局限性，受生理、病理等諸多因素的影響可導致正反定型不符。而基因分型方法在某些程度上克服了血清學試驗的弱點，可以作為血清學方法的有益補充，為臨床輸血以及法醫中親子鑒定、個體識別提供強有力的檢測手段[1]。本實驗采用PCR-SSP法對ABO正反定型不符的標本作基因分型，報告如下。

1 材料與方法

1.1 對象本實驗室和各大醫院送檢的血清學ABO正反定型不符，血型存在疑問的血樣共10例。

1.2 血清學檢測試劑與方法抗A、抗B標準血清、ABO試劑紅細胞、篩選紅細胞、譜細胞購自上海市血液中心。ABO血型鑒定采用試管法鹽水正反定型，抗體篩選和抗體鑒定采用間接抗人球法。

1.3 標本的基本情況10個樣本全是先正反定型不符，放至4℃以及放散試驗均未得出結果。1號為高效價的冷集素和溫抗體，3、4、9號為健康無償獻血者，5號為淋巴瘤患者，10號為血液病患者，6號為抗原減弱，2、7、8號為醫院送來的正反定型不符標本。ABO血型檢測血清學反應格局見表1。

1.4 DNA提取采用鹽酸胍為基礎的提取方法。鹽酸胍溶液使細胞裂解，蛋白質變性，促進DNA與硅膠模結合，經過清洗和洗脫得到DNA。(由TBG公司提供)

表1 10例標本的血清學反應格局

1.5 擴增引物ABO血型基因引物由天津秀鵬生物技術開發有限公司提供。見表2。

表2 ABO基因引物PCR產物片段

1.6 總反應體系10μl 0.1μlTAq酶(5U/μl)，0.9μlDNA(30ng/μl)，9μldNTP-Buffer工作液。

1.7 PCR擴增使用美國PE9700型PCR擴增儀，擴增條件，96℃2min；96℃20s,68℃60s5個循環；96℃20s,65℃45s,72℃30s10個循環；96℃20s,62℃45s,72℃30s15個循環；72℃3min；4℃保存。

1.8 PCR擴增產物的檢測將每個PCR反應產物(5～10μl)轉移到2.5%的瓊脂榶凝膠孔中，140～150V電泳15～20min，觀察結果，根據是否產生特異性條帶，并與結果分型表相比對，從而檢出血型。

2 結果

2.1 PCR擴增產物電泳結果見圖1。

圖1 ABO基因擴增片段電泳圖譜

2.2 樣品基因型與血清學檢測結果比較見表3。

表3 ABO基因檢測結果與血清學檢測結果相比較

3 討論

ABO血型系統有A、B、O三個基因，基因組DNA長度約30Kb，位于9q34.1-9q34.2其核苷酸序列高度保守，ABO基因之間具有幾個堿基替換或單個堿基缺失，他們具有高度的同源性。B基因在cDNA上的297、526、657、703、796、803、930位有7個核苷酸與A基因不同[2]，使其編碼的B轉移酶的特異性不同于A轉移酶。O基因只是cDNA的第261位核苷酸不同，第261位胞嘧啶在O基因中的缺失，造成了O基因在261位后發生閱讀框架的移動，形成了新的終止密碼子，提前終止了轉移酶的翻譯，使其編碼出的蛋白只有115個氨基酸，并且沒有轉移酶的催化功能[3]。

血清學方法鑒定ABO血型是通過檢測血型抗原和抗體來去確定，疑難者再附加吸收放散試驗、唾液定型等項目，而抗原、抗體在不同亞型或某些疾病會產生強弱變化影響血型的判斷[4],這時結果判讀的主觀性較大，不同實驗室甚至不同實驗人員之間的結果可比性不強，試劑的質量對于鑒定結果有決定性影響等[5,6]。DNA不受上述因素的影響，ABO基因座位由7個外顯子組成，決定A、B轉移酶特異性的是第4、7外顯子編碼的氨基酸序列，迄今，已發現有30多種ABO亞型基因序列[7]，這些具有序列多態性的等位基因構成了ABO血型分子生物學分型的基礎[8]。PCR-SSP技術檢測ABO血型基因型是利用ABO基因發生突變位點的不同核苷酸，分別設計一系列序列特異性引物，直接擴增ABO血型基因DNA片段從而測得ABO血型及其亞型[9]。PCR-SSP法與血清學方法相比，克服了血清學鑒定只能鑒定表現型的局限，標本1、5、10號不受疾病的影響；其它標本血清學的假凝集、弱凝集現象血型鑒定均得到快速解決。患者經基因檢驗確定血型，給予同型血輸注治療取得滿意效果。

總之，用PCR-SSP法檢測血型方法可靠，并可精確到亞型，避免了結果誤差，對指導臨床診斷處理提供了理論依據。

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R457.1+1

A

1674-1129(2013)05-0444-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.05.014

江西省衛生廳資助項目(編號20073179)

肖莉，女，1975年5月，畢業于南昌大學醫學院，學士學位，副主任技師，主要從事輸血醫學研究。

李國良，男，1968年6月生，碩士學位，主任醫師，主要從事輸血醫學研究