黑龍江省西瓜細菌性果斑病發(fā)生初報

王文博 劉 東 張艷菊

（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，黑 龍江哈爾濱 150030）

近年來，黑龍江省西瓜種植面積穩(wěn)定在21.5 萬hm2，總產(chǎn)量450 萬t，總產(chǎn)值30 億元左右（王喜慶，2008）。隨著優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種的引進，生產(chǎn)上出現(xiàn)一種新的病害，侵染初期，果皮上出現(xiàn)直徑幾毫米的水浸狀凹陷斑點，隨后迅速擴展為直徑幾厘米不規(guī)則的大型病斑，發(fā)病中后期，果肉變成水浸狀，果皮龜裂，溢出粘稠、透明的琥珀色菌膿。該病害一旦發(fā)生難以控制，不但降低西瓜品質(zhì)，而且影響其經(jīng)濟價值，果實只要發(fā)病就失去了商品價值，對黑龍江省西瓜生產(chǎn)構(gòu)成嚴重威脅，給瓜農(nóng)造成了巨大的經(jīng)濟損 失。2010年筆者在發(fā)生上述癥狀的黑龍江省哈爾濱市和雙城市西瓜田采集病樣，進行了病原菌的分離、鑒定，以期明確病害發(fā)生原因，為病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的采集及分離、純化

2010年7月在黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)、雙城市西瓜田采集發(fā)病果皮及種子，進行分離檢測。在NA 培養(yǎng)基上采用平板劃線法進行分離和純化（方中達，1997），30℃培養(yǎng)48～72 h。獲得純化培養(yǎng)的菌株4個。

1.2 病原菌的致病性測定

將獲得的菌株在30℃培養(yǎng)48 h，制成108cfu·mL-1的菌懸液，采用針刺法（金巖 等，2004）將配好的菌懸液接種到西瓜果實上，以接種清水為對照。28℃保濕72 h后觀察發(fā)病情況。出現(xiàn)病癥后，從病斑上再分離病菌，按柯赫氏法則進行鑒定。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 病原菌的形態(tài)觀察及染色 對有致病性的菌株，用結(jié)晶紫草酸胺染色法（方中達，1997）進行革蘭氏染色。采用透射電鏡的負染技術(shù)觀察病原菌的鞭毛著生位置及數(shù)目、菌體形態(tài)，測量菌體大小。

1.3.2 病原菌的生理生化性狀測定 各菌株在NA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，參照Schaad 等（2001）的方法對病原菌的耐鹽性、對碳源的利用等生理生化性狀進行測定。

1.3.3 細菌16S rDNA 序列分析 采用CATB 法提取待測細菌基因組DNA（Ausubelm et al.，1998）。以提取的DNA 為模板，采用細菌的16S rDNA 通用引物進行PCR 擴增（滕齊輝 等，2006）。引物序列為：上游引物F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物R：5′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系：2.0 μL dNTP（2 mmol·L-1），引物F（10 μmol·L-1）、引物R（10 μmol·L-1）各1 μL，1 μLTaq酶（1U·μL-1），2.5 μL Buffer（10×），2 μL MgCl2（25 mmol·L-1），雙蒸水14.5 μL，模板DNA 1 μL。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 4 min；94℃變性 50 s，55℃退火 45 s，72℃延伸110 s，循環(huán) 30次；72℃保持10 min，最后在4℃下保存。擴增產(chǎn)物回收后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序部（北京）測序。測序結(jié)果與GenBank 中的核酸序列進行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間發(fā)病癥狀

田間發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)在向陽面的西瓜果實表面，發(fā)病初期在果皮上出現(xiàn)直徑幾毫米的暗綠色水漬狀凹陷斑點，后擴展為不規(guī)則的直徑幾厘米的大型病斑，果肉變成水浸狀，果皮龜裂，常溢出粘稠、透明的琥珀色菌膿（圖1）。

2.2 病原菌致病性測定

從發(fā)病果實上分離得到4個菌株，經(jīng)致病性測定，H1（分離自哈爾濱市）和S1（分離自雙城市）2個菌株對西瓜果實有致病性，在果皮上形成大的暗綠色水漬狀病斑，最后果實腐爛，與田間發(fā)病癥狀一致。將接種后發(fā)病的果皮再次進行分離培養(yǎng)及接種鑒定，得到與最初分離相同的原病菌及癥狀。說明這2個菌株均為致病菌。

圖1 田間發(fā)病癥狀

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 病原菌形態(tài)及染色反應(yīng) 具有致病性的2個菌株在NA 平板上30℃生長1 d后均形成圓形、隆起、光滑、不透明的乳白色菌落，菌落直徑可達2～3 mm，無明顯色素產(chǎn)生。2個菌株革蘭氏染色反應(yīng)均為陰性，菌體呈短桿狀，直或稍彎，大小為（1～2）μm×（0.5～1.0）μm；鞭毛極生、單根，長4～5 μm（圖2）。

圖2 病原菌的電鏡照片

2.3.2 生理生化性狀 供試H1 和S1 2個菌株的生理生化特性表現(xiàn)一致。生長最適溫度為30℃，最低10℃，最高42℃，致死溫度為51℃15 min。在碳源利用方面，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖和山梨醇，但不能利用D-木糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、麥芽糖、鼠李糖、肌醇、奎尼酸和甜菜堿。能使明膠液化，但不能產(chǎn)生果聚糖，不能產(chǎn)生吲哚，不能使淀粉水解，過氧化氫酶、氧化酶和硝酸鹽還原試驗呈陽性，能利用吐溫80，MR 試驗（甲基紅試驗）和V-P試驗（產(chǎn)生3-羥基丁酮試驗）呈陰性，馬鈴薯軟腐試驗呈陰性，3%耐鹽性試驗呈陽性（表1）。

表1 待測菌株生理生化測定結(jié)果

2.3.3 細菌16S rRNA 序列分析 用細菌16S rRNA 通用引物擴增待測菌株H1 和S1 的16S rDNA，均得到1條1 400 bp 左右的條帶（圖3），擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將所得到的序列結(jié)果與GenBank中的核酸序列進行比對分析。結(jié)果表明，H1 與GenBank 中的燕麥嗜酸菌西瓜亞種Acidovorax avenaesubsp.citrulli（登錄號分別為FJ447560.1、FJ447558.1、FJ447559.1、AM850114.1）的同源性為100%，S1 菌株與上述幾個菌株和AF078761.1 的同源性為89%～99%（表2）。

圖3 菌株H1、S1 的PCR 擴增結(jié)果

表2 GenBank 中與供試菌株H1、S1 的16S rDNA 序列同源性最高的菌株

3 結(jié)論與討論

有關(guān)西瓜細菌性果斑病的報道多集中在國外，最早于1969年在美國弗羅里達州由Crall 和Schenck（1969）報道。1978年在《植物病害手冊》上描述了昆士蘭、澳大利亞發(fā)生的細菌性果斑病在果實上的典型癥狀并認為其病原菌是假單胞菌（Pseudomonas）（Vock & Hampson，1978）。1988年Wall 和Santos（1988）報道在關(guān)島有西瓜細菌性果斑病的發(fā)生，并首次將其病原菌鑒定為類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種（Pseudomonas pseudoalcaligenessubsp.citrulli）。1989年該病在美國各州暴發(fā)，對西瓜造成嚴重危害后，Wall（1989）才把病瓜和病苗聯(lián)系起來，從而知道果斑病菌對幼苗和果實均能侵染。此后該病在土耳其、韓國等地相繼出現(xiàn)并有報道（Hopkins，1989；Jec，1990；Latin & Rane，1990；Evans & Mulrooney，1991；Jacobs et al.，1992；Black et al.，1994；Demir，1996；Hamm et al.，1997）。直到1992年Willems 等（1992）根據(jù)西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA 和DNA-DNA 分子雜交研究結(jié)果，將其更名為Aciuovorax avenaesubsp.citrulli。國內(nèi)1987年李明遠（1987）報道了該病在北京的發(fā)生，張榮意等（1998）對在海南省樂東和東方兩縣采集的3個菌株進行了鑒定，將其病原菌鑒定為Acidovorax avenasubsp.citrulli。許瑛玲等（2000）報道了1997年以來在臺灣的甜瓜種植區(qū)發(fā)生的細菌性果斑病，并將其病原鑒定為Acidovorax avenaesubsp.citrulli。張昕等（2001）報道了在新疆哈密瓜上發(fā)現(xiàn)了細菌性果斑病菌（Acidovorax avenaesubsp.citrulli）。同年，趙廷昌等（2001）報道了在內(nèi)蒙古和新疆的哈密瓜上有細菌性果斑病的發(fā)生。金巖等（2004）在吉林、蔡學清等（2005）在福建、趙廷昌等（2009）在山東省壽光市和昌樂縣均發(fā)現(xiàn)并報道了該病。

本試驗對采自黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)和雙城市病瓜上的細菌進行分離純化、致病性測定、形態(tài)觀察、染色反應(yīng)、生理生化測定和16S rDNA 的序列分析，確定在黑龍江省阿城、雙城地區(qū)西瓜上的病害為由Acidovorax avenaesubsp.citrulli引起的西瓜細菌性果斑病。本試驗是首次報道黑龍江省西瓜細菌性果斑病的發(fā)生，對指導(dǎo)黑龍江省西瓜細菌性果斑病的檢疫和防治具有重要意義。

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