48份分蘗洋蔥種質資源遺傳多樣性的ISSR標記和農藝性狀分析

金 雪 周新剛 劉守偉 劉淑芹 吳鳳芝

（東北農業大學園藝學院，黑龍江哈爾濱 150030）

分蘗洋蔥（Allium cepavar.aggregatum）為百合科（Liliaceae）蔥屬（Allium）一年生栽培草本植物，是洋蔥的一個變種（李曙軒 等，1979；崔崇士和傅喜山，2000）。分蘗洋蔥營養豐富，藥用價值較高，是重要的世界性蔬菜和調味品，在我國東北地區，如黑龍江、吉林等地廣泛種植。分蘗洋蔥生育期短，病蟲害較輕，能有效提高土地復種指數，減少農藥使用量，適于發展綠色食品，市場前景較好。但長期以來分蘗洋蔥品種的篩選鑒定工作尚不深入，品系分類不清楚，可能存在同物異名現象，不利于分蘗洋蔥的推廣和應用。

目前同工酶標記（Rouamba et al.，2001；高述民 等，2003；張光花 等，2003）、SSR（Simple sequence repeats）標記技術（Fischer ＆ Bachmann，2000；李慧芝 等，2007；周靜 等，2011）、ISSR（Inter-simple sequence repeat）標記技術（徐啟江 等，2007；劉宏敏 等，2011）、rDNA原位雜交技術（Ricroch et al.，1992）及形態學與分子生物學相結合的方法（Sangecta et al.，2006）已廣泛用于大蔥、大蒜、洋蔥等蔥屬作物的遺傳多樣性研究，并已經取得了較大進展。而分蘗洋蔥種質資源的遺傳多樣行分析尚處于起步階段（初文嬌，2010）。

由Zietkiewicz 等（1994）發展起來的ISSR（Inter-simple sequence repeat）技術具有操作簡便、快速、多態性高、重復性好等特點，已在許多作物的親緣關系分析、遺傳多樣性研究等方面得到了廣泛應用（王武臺 等，2011）。本試驗搜集了在黑龍江省和吉林省廣泛種植的48份分蘗洋蔥種質資源，對其進行了田間農藝性狀調查和ISSR 標記，以期揭示其遺傳多樣性及親緣關系，為分蘗洋蔥的品種評價與鑒定、引種栽培等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的分蘗洋蔥材料共48份（表1），為從黑龍江省和吉林省不同地區搜集的地方品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間農藝性狀調查 田間試驗于2011年4～7月在東北農業大學試驗田進行。48份分蘗洋蔥材料每份材料播種1行，行距30 cm，行長9 m，有效播種數為180株，株距5 cm。田間管理按常規進行。調查的農藝性狀包括分蘗洋蔥的幼葉色、是否抽薹、鱗莖色和單球質量。于種植后30 d（幼苗期）觀察分蘗洋蔥的幼葉色，將幼葉色劃分為3 類：淺綠、翠綠和深綠；種植后90 d（收獲前）調察是否抽薹；收獲后觀察鱗莖色，將鱗莖色劃分為4 類：淺棕黃色、棕黃色、黃色和紫黃色。

1.2.2 基因組DNA 提取 植株長至3～4片葉時，取分蘗洋蔥嫩葉的新鮮組織并保存于-80℃冰箱。采用TIANGEN 公司柱式植物基因組試劑盒進行基因組DNA 提取。提取的基因組DNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用紫外分光光度計測定其濃度和純度。

1.2.3 ISSR分析 ISSR所用引物序列見表2（姜福星，2006；徐啟江 等，2007；鄧文明，2008），由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR 反應總體積為50 μL，其中10×Buffer 5 μL，Mg2+3 μL，dNTP 4 μL，DNA 20 ng，Taq酶（TIANGEN 公司）0.8 U，10 μmol·L-1引物2 μL。PCR 擴增反應在Bio-Rad PTC200 PCR 儀（Bio-Rad 公司）上進行，擴增程序為：94℃預變性5 min；35個熱循環，每個循環包括94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s；終延伸72℃ 10 min。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，100 V 電壓，150～180 min，并以100～2 000 bp 標準分子量為對照。用Gelred 染色20 min后，用紫外分析儀觀察并記錄擴增結果。

1.2.4 數據分析 ISSR 電泳結果，對清晰可辨的電泳條帶全部用于統計分析，按擴增條帶有無記數，當某一擴增帶出現時，賦值為“1”，不存在時賦值為“0”，從而把圖形資料轉換成數據資料。根據Nei 和Li（1979）相似系數法求得品種i和j之間的相似系數（GSij）：GSij=2Nij/（Ni+Nj），其中，Nij表示品種i，j共有的條帶數目，Ni表示品種i中的條帶數目；Nj表示品種j中的條帶數目。利用NTSYSpc Version2.0 軟件（Rohlf，1987）按照UPGMA法進行聚類分析，并構建樹狀圖。

表型性狀數據標準化后用NTSYS 軟件分析，按照遺傳距離進行UPGMA 聚類分析。

表2 所用引物序列及其多態性

2 結果與分析

2.1 ISSR 多態性分析

從51條ISSR 引物中篩選出了13條能擴增出清晰帶型、多態性較好的引物。這13條引物中有7條二核苷酸重復序列，1條三核苷酸重復序列，1條四核苷酸重復序列，4條簡并性核苷酸重復序列。二核苷酸重復序列中（CT）n 擴增出的條帶數最多，說明分蘗洋蔥基因組中含有豐富的CT 重復序列，這為下一步利用ISSR 標記定向開發分蘗洋蔥SSR 引物奠定了基礎。

用13條引物（表2）對48份分蘗洋蔥材料進行PCR 擴增，所擴增的片段大小在100～2 000 bp 之間（圖1）。13條引物共擴增出132條條帶，其中多態性條帶109條，多態百分率（P）為82.6%，平均每條引物擴增出10.15條條帶（表2）。其中，引物3A35 擴增出的條帶數最多，為18條，多態百分率為94.4%；引物UBC812 擴增出的條帶數最少，為3條；多態性最高的引物是UBC840，多態百分率達100%（表2）。說明ISSR 標記擴增效率較高且多態性較好。

圖1 引物UBC840 對48份分蘗洋蔥材料的ISSR 擴增電泳圖譜

2.2 ISSR 標記聚類分析

48份分蘗洋蔥的遺傳相似系數變化范圍在0.59～0.94，平均為0.75，表現出豐富的多樣性。其中賓縣1 和賓縣2，白城1 和雙城2 之間的相似系數最大，均為0.94，表明其親緣關系較近；綏化和阿城、四平和南方毛蔥、五常紅七社和四六瓣的相似系數最小，均為0.59，表明其親緣關系較遠。吉林省和黑龍江省兩省樣品的相似系數變化范圍分別為0.62～0.90、0.59～0.94，平均相似系數為吉林省0.72<黑龍江省0.74，表明來自黑龍江省的樣品遺傳多樣性低于來自吉林省樣品。

從聚類分析樹狀圖（圖2）可以看出，在相似系數為0.75（L1）處，48份分蘗洋蔥資源可分為3 類：Ⅰ類有6份資源來自吉林省，17份來自黑龍江省，相似系數為0.73～0.94，該類中可繼續分為若干亞類和次亞類，遺傳多樣性較豐富；Ⅱ類只包括1份資源，為來源于黑龍江省的南方毛蔥，在相似系數為0.71 的水平上與其他所有材料分開，表明這份材料有特殊的基因，建議進一步試驗；Ⅲ類包括24份資源，其中4份來源于吉林省，20份來源于黑龍江省，相似系數為0.81～0.92，遺傳差異比較明顯。在相似系數為0.81（L2）處，可將Ⅰ類再 分為4個亞類：Ⅰ-a包括1份資源，為吉林；Ⅰ-b 包括18份資源，4份源于吉林省，其余來自黑龍江省；Ⅰ-c 包括五常紅七社和1號2份資源；Ⅰ-d 只有1份資源，為長春。

2.3 農藝性狀分析

農藝性狀觀察結果見表3。利用表3中的表型性狀數據計算了材料間的遺傳相似系數，結果表明，48份分蘗洋蔥材料間的遺傳相似系數變化范圍為0.38～1.00，平均為0.64。利用上述農藝性狀觀察結果構建的聚類分析樹狀圖（圖3）表明：在遺傳相似系數為0.60 處可將48份材料分為3 類：Ⅰ類包括西林、獨頭等18份資源，其中5份來自吉林省；Ⅱ類包括28份資源，其中來自吉林省的內蒙、吉林、農安1、四六瓣、吉林2 等遺傳距離較近；Ⅲ類包括2份資源，4號和南方毛蔥。

圖2 48份分蘗洋蔥材料的ISSR 標記聚類分析樹狀圖（UPGMA 法）

表3 48份分蘗洋蔥表型性狀觀察結果

續表

圖3 48份分蘗洋蔥材料的農藝性狀聚類分析樹狀圖（UPGMA 法）

3 結論與討論

ISSR分子標記結果穩定性高，不受樣品形態、基因表達與否及環境因子的限制（Joshi et al.，2000；Pradeep Reddy et al.，2002；Gupta et al.，2010；Tanya et al.，2011），且在蔥屬作物分類、進化和遺傳多樣性的研究中應用很多。梁景霞等（2008）應用18個多態性引物對96份有代表性的煙草種質進行PCR 擴增，共獲得314條穩定條帶，其中多態性條帶299條（占95.2%）。劉宏敏等（2011）以96份有代表性的韭菜資源為材料，進行遺傳多樣性和親緣關系分析，發現韭菜DNA 的ISSR 擴增多態性比率達94.7%，認為ISSR 是韭菜種質資源研究的一種有效分子標記。

品種間遺傳關系研究和遺傳多樣性分析對于分析作物育種具有十分重要的意義（Schut et al.，1997）。本試驗以13條ISSR 引物對48份分蘗洋蔥材料共擴增出132條條帶，其中多態性條帶109條，多態百分率（P）為82.6%，平均每條引物擴增出10.15條條帶。供試48份分蘗洋蔥的遺傳相似系數變化范圍在0.59～0.94，其中賓縣1 和賓縣2、白城1 和雙城2 在分子水平上的遺傳相似系數達0.94，親緣關系較近，說明其可能是同物異名的品種；而南方毛蔥與其他資源的相似系數較小，在0.59～0.75 之間，可作為資源研究和育種的材料。ISSR 擴增片段多態性較高，遺傳相似系數變幅較大，說明分蘗洋蔥在分子水平上遺傳多樣性較豐富。這可能是由于以下幾點原因：首先，分蘗洋蔥在長期進化過程中，為了適應不同的生態型，分化出了不同的種質資源；其次，分蘗洋蔥為無性繁殖，不易發生變異，適應外界環境條件差，只有遺傳基礎豐富的種質才能存活下來；另外，由于過去對分蘗洋蔥研究的投入較少，育種目標的定向選擇機會較少，多樣性性狀丟失也較少。

ISSR分子標記的UPGMA 聚類結果表明，48份分蘗洋蔥種質資源可分為三大類，與基于農藝性狀的聚類結果基本一致。兩者均表明多數種質資源之間的親緣關系與地理來源具有較大相關性，如來自黑龍江省的大部分種質聚為一類，來自吉林省的四平和吉林2 聚為一類。但也有地理來源差距較大的種質聚為一類，如白城1 和雙城2 聚在一起，這可能是近時間內黑龍江省與吉林省之間分蘗洋蔥種質資源的頻繁交流所致。但是，兩種方法的聚類結果也存在一些差別，這可能是由于ISSR 標記體現的是種質資源間分子水平上的差異，是遺傳因素的體現，而且檢測出的分子水平差異并不都與所觀測的農藝性狀相關聯；而表型性狀的差異是基因與環境共同作用的結果（Eivazi et al.，2008）。另外，理想的分子標記應具有多態性高、共顯性遺傳、遍布整個基因組、檢測手段簡單快速、成本低廉、重復性好等要求。但是，目前發現的任何一種分子標記均不能滿足以上所有要求。例如，擴增片段長度多態性標記技術（AFLP）具有最高的多態性檢測效率，但多態信息量不高；簡單重復序列標記技術（SSR）標記具有多態性高，遺傳信息量大等優點（Ali et al.，2008），如果AFLP位點能夠定位在SSR 遺傳連鎖圖譜上，那它將是非常有效的分子標記（Haussmann et al.，2002；Geleta et al.，2006）。應進一步結合SSR、AFLP等分子標記方法進行比較分析，從而更準確地反映不同分蘗洋蔥種質資源間的遺傳關系。

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