介入干預對原發性肺癌細胞耐藥基因的影響

楊紹娟，薄立華，吳曉冬＊

（吉林大學中日聯誼醫院1.病理科；2.中心研究室，吉林 長春 130033）

介入干預包括動脈灌注與動脈栓塞是原發性肺癌綜合性干預的重要措施之一［1］，但肺癌細胞的多藥耐藥性嚴重制約了介入干預的遠期療效。為了解原發性肺癌耐藥基因的表達與不同介入干預方法的關系，本文對未行化療而經支氣管鏡活檢和手術的肺癌標本行介入干預后經支氣管鏡活檢和手術的肺癌標本，應用免疫組化方法檢測癌細胞中耐藥基因的表達情況，利用具有高分辨能力和精確定量特征的流式細胞術研究肺癌細胞PgP、GSTπ蛋白表達在肺癌早期耐藥發生中的作用以及與細胞周期的關系，并探討其臨床意義［2，3］。

1 材料與方法

1.1 病例來源 選擇我院2008年10月至2011年5月經支氣管鏡活檢和手術切除的肺癌標本（包括肺鱗癌、腺癌、小細胞癌）97例。其中男54例，女43例，年齡36～65歲。

1.2 病例分組 根據支氣管鏡活檢和手術前有無實施化療分為非化療組（36例）和介入治療組（61例）。同時，介入干預組根據是否加行動脈栓塞再分為非栓塞組與栓塞組。

1.3 介入方法 常規經皮股動脈穿刺插管，行支氣管動脈造影，了解腫瘤供血情況，選擇性和超選擇性供血動脈插管。根據是否應用碘油抗癌藥乳劑栓塞支氣管動脈分為非栓塞組與栓塞組。非栓塞組（33例）：單純行動脈灌注化療藥物卡鉑（CBP）或順鉑（DDP）、絲裂霉素（MMC）、5－氟尿嘧啶（5 Fu）等，干預2～3次。栓塞組（28例）：將導管插入相應支氣管動脈，常規灌注化療藥物，隨后用超液態碘油10ml加DDP 40mg、MMC10mg及非離子型對比劑（優維顯300）5ml反復推抽（泵法）制成乳劑，在X線監視下經導管緩慢注入，干預1～3次。

1.4 免疫組化方法 石蠟組織標本切片，脫蠟至水化，所用一抗為福州邁新公司鼠抗人P糖蛋白（PgP）和谷胱甘肽硫轉移酶π（GSTπ）抗體，二抗為通用型免疫球蛋白G（Ig G）辣根過氧化物酶多聚體，二氨基聯苯胺顯色后復染，封片。陽性結果判斷：PgP、GSTπ陽性結果為在細胞漿或（和）細胞膜上出現棕色顆粒，隨機觀察200個細胞，根據陽性細胞數和染色強度分級，＜5%為陰性，陽性標本每增加25%為一級［3］。

1.5 免疫熒光染色及檢測 分別加入特異性第一抗體即抗PgP、GSTπ蛋白單抗37℃恒溫水浴孵育30 min，PBS離心洗滌2次，去盡上清液體，加入FITC標記的二抗，在37℃水浴30 min，PBS離心洗滌2次以除去未結合的多余抗體。200目鋼篩過濾。檢測時設陰性對照（以PBS代替一抗），在流式細胞儀上檢測FITC在受488 nm氬離子激光激發的熒光強度，得出細胞群體在各時相PgP、GSTπ蛋白的表達率。

1.6 統計學分析 統計均經r×2形式及χ2值分割方法處理。

2 結果

2.1 免疫組化檢測 97例肺癌病例中，33例非栓塞組PgP與GSTπ陽性表達率（21例63.6%、23例69.7%）明顯高于36例非化療組（16例44.4%、15例41.7%），P 值均＜0.01；非栓塞組PgP與 GSTπ陽性表達率明顯高于28例栓塞組（14例50.0%、13例46.4%），P值均＜0.01；栓塞組PgP與 GSTπ陽性表達率與非化療組比較無明顯差異，P＞0.05（見表1）。

2.2 FITC熒光強度間接反映細胞膜PgP、GSTπ蛋白表達率 由表2可見，非栓塞組PgP、GSTπ蛋白表達明顯高于非化療組、栓塞組，P值均＜0.01；栓塞組PgP、GSTπ蛋白表達與非化療組相比無明顯差異，P＞0.05。

表1 各組的PgP、GSTπ陽性表達比較

表2 流式細胞術雙參數標記檢測各干預組中的PgP、GSTπ蛋白（x—±s）干預方法 n PgP表達率（%）GSTπ表達率（%）非栓塞組15 6.07±1.36 2.46±0.28栓塞組 15 3.05±1.07 1.21±0.14非化療組10 2.78±1.13 1.08±0.09

3 討論

原發性肺癌是危害人類生命的重要疾病之一，采用介入療法是干預原發性肺癌的重要手段，而腫瘤細胞在各種化療藥物環境中仍能不同程度地繼續存活與生長，這就限制了介入治療的遠期療效。腫瘤細胞耐藥的生物學基礎取決于本身細胞的多藥耐藥基因（MDR）。現已證實人類組織中的MDR有2種亞型，MDR1在腫瘤生成過程中可表達增高，產生多藥耐藥性；而MDR2經研究證實與腫瘤細胞的耐藥性無關［4］。MDR1表型的標志是一種跨膜糖蛋白，稱為PgP，將有毒的親脂性藥物逆著梯度轉運到細胞膜外，以降低毒性藥物在細胞內的聚集［5］，從而導致化療的失敗。PgP的過度表達與多種腫瘤的耐藥有關［6，7］。GSTπ是谷胱甘肽硫轉移酶（GST）的亞型之一，主要催化還原性谷胱甘肽與親電性物質間的反應，對生物細胞起保護作用，參與MDR的耐藥發生。經研究發現GSTπ在許多腫瘤中表達均升高，而在正常組織表達率很低，它可能成為某些腫瘤（肺癌、胃腸癌、宮頸癌等）的標志酶，對腫瘤的早期診斷有重要意義［8］。

本研究表明，多藥耐藥陽性表達在介入栓塞組與非化療組無顯著性差異，非栓塞組采用單純動脈灌注化療法，使多藥耐藥性陽性表達明顯升高，證明介入化療栓塞干預抑制腫瘤細胞耐藥性產生的效果明顯優于單純動脈灌注化療［9］。這可能與選用的超液態碘油抗癌藥乳劑作為栓塞劑有關，其可選擇性進入瘤體內，閉塞腫瘤血管，并可進入肺組織的毛細血管床，達到支氣管動脈和肺動脈雙重栓塞的目的，在瘤體內碘油與抗癌藥緩慢分離局部藥物濃度高，作用持久；但關于化療栓塞影響耐藥的詳細機制有待于進一步研究。本研究證明，檢測癌組織中的PgP與GSTπ對肺癌的化療有重要的指導意義，鑒于支氣管動脈灌注化療可使肺癌中多藥耐藥性的陽性表達增高，而化療栓塞支氣管動脈對癌細胞耐藥性產生的誘導性較小，因而，在行介入療法干預肺癌時，應提倡精細操作，在化療方案個體化的基礎上，對肺癌的介入干預應盡可能選擇化療栓塞，并聯合應用耐藥逆轉調節劑，以提高療效。

臨床耐藥的表型存在差異，臨床肺癌、肝癌等存在內源性耐藥，且耐藥倍數很低，個體耐藥差異很大［10］。因此，充分利用免疫技術檢測耐藥基因的蛋白表達將為臨床肺癌多藥耐藥的研究提供很好的手段。

［1］邱春麗，趙文軒，代引海，等.支氣管動脈介入灌注栓塞治療中晚期肺癌療效分析［J］.當代醫學，2010，17：320.

［2］Shinohara N，Liebert M，Wedemeyer G，et al.Evaluation of multiple drug resistance in human bladder cancer cell lines［J］.J Urol，1993，150：505.

［3］Pujol JL，Simony J，Gautier V，et al.Immunohisto chemical study of Pglycoprotein distribution in lung cancer［J］.Lung Cancer，1993，10：1.

［4］Lau A，Nightingale S，Taylor GP，et al.Enhanceed MDR1 gene expression in human T－cell leukaemia virus I infected patients offers new propects for therapy［J］.Blood，1998，91：2467.

［5］潘啟超，胥 彬，編著.腫瘤藥理學與化學治療學［M］.鄭州：河南醫科大學出版社，2000：396－399.

［6］Sharp SY，Smith V，Hobbs S，et al.Lack of a role for MRP1 in platinum drug resistance in human ovarian cancer cell lines［J］.Br J Cancer，1998，78：175.

［7］Britten RA，Green JA，Warenius HM.Celluar glutathione（GSH）and glutathione s－transferase （GST）activity in human ovarian tumor biopsies following exposure to alkylating agents［J］.Int J Radiat Oncol Biol phys，1992，24：527.

［8］李之山，張汝剛，羅賢懋，等.谷胱甘肽硫轉移酶π在人食管鱗癌的表達［J］.中華腫瘤雜志，2001，23：39.

［9］孫 鋼，金 鵬，謝宗貴，等.介入治療對耐藥基因在原發性肺癌表達的影響［J］.中華放射學雜志，2002，36：806.

［10］徐 萌，李金瀚，等肺癌耐藥發生和細胞周期改變的流式細胞術分析［J］.中華腫瘤雜志，2000，22（5）：385.