ITP小鼠模型中NO／NOS對ROS生成影響作用的研究

金呈強，董海新＊，劉 仿

（1.濟寧醫學院附屬醫院 檢驗科，山東 濟寧 272029；2.廣東醫學院 微生物與免疫學教研室，廣東 湛江 524023）

特發性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP），又稱自身免疫性血小板減少性紫癜（autoimmune thrombocytopenic purpura，AITP），是因免疫機制使血小板破壞增多的臨床綜合征，是較為常見的出血性疾病，也是最常見的一種血小板減少性紫癜［1］。為探討ITP模型小鼠體內NO／NOS對ROS生成影響的作用，我們使用NO供體藥物硝普鈉稀釋液腹腔注射ITP模型小鼠后，用ELISA法分析不同時間點小鼠外周血中NO／NOS和ROS濃度的變化情況。

1 材料及方法

1.1 實驗對象

同齡SPF級云南昆明小鼠46只，雌雄兼用，體重（20±6）g，購于廣東醫學院試驗動物中心。

1.2 實驗試劑

注射用硝普鈉（規格：50 mg；北京雙鶴現代醫藥技術有限責任公司）；NO及NOS試劑盒（南京建成生物工程研究所第一分所），Fenton反應活性氧（ROS）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 ITP模型的建造

將小鼠抗人C反應蛋白（CRP）單抗、人血清白蛋白和抗小鼠血小板膜糖蛋白（GPIIb／IIIa）單抗（MWReg30）以一定比例混合后裝入微型滲透泵，將其植入小鼠皮下組織，使MWReg30以0.25μl／h的速度持續緩慢地釋放至小鼠體內（持續14天）［2］。

1.4 實驗方法

將注射用硝普鈉50 mg（1支）溶解于50 ml生理鹽水溶液中備用。將模型小鼠隨機分為2組：NO供體藥物硝普鈉（SNP）組和磷酸鹽緩沖液（PBS）對照組，SNP組用相同濃度（1 mg／ml）的 NO供體藥硝普鈉稀釋液0.5 ml進行腹腔注射，PBS對照組使用相同體積的磷酸鹽緩沖液進行腹腔注射，用藥第5 min，15 min，25 min，35 min和45 min后（每個實驗點至少3只）取血。具體方法為用乙醚麻醉小鼠后，進行頸動、靜脈分離手術，待頸動脈暴露清楚后，使用注射器刺入動脈血管，抽取3 ml血量，離心分離血清，用ELISA法分別檢測血清中NO、NOS和ROS的含量。

1.5 ELISA法檢測NO含量、總NOS活性及ROS濃度

收集分離后的血清，嚴格按照硝酸還原酶法檢測NO含量。蒸餾水調零，于550 nm，0.5 cm光徑測量各管吸光度值，計算出NO的濃度，以μmol／L表示。嚴格按照一氧化氮合酶測定試劑盒說明書，分光光度計530 nm處，1 cm光徑，測各管的吸光度值，計算出總NOS的濃度，以U／ml表示。ROS濃度嚴格按照Fenton反應活性氧（ROS）ELISA試劑盒說明書進行檢測，以蒸餾水調零，于550 nm、0.5 cm光徑測定各管的吸光度值，計算ROS濃度，以U／ml表示。

1.6 統計學分析

全部數據用（±s）表示，均經SPSS17.0統計軟件分析。兩樣本均數比較采用t檢驗，兩變量的相關程度用直線相關分析法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SNP對ITP模型小鼠NO含量的影響

如表1所示，PBS對照組NO含量的測定結果各不同時間點測量值無顯著性差異（均P＞0.05），而SNP組在第5 min，15 min，25 min，35 min和45 min檢測的NO含量逐漸升高，各測量值之間有著顯著性差異（均P＜0.05），試驗組在第5 min，15 min，25 min，35 min、45 min測量結果和 PBS對照組相比有著顯著性差異（均P＜0.05）。

2.2 SNP對ITP模型小鼠NOS活性的影響

如表2所示，對照組NOS活性的測定結果之間無顯著性差異（均P＞0.05），而SNP組在第5 min，15 min，25 min，35 min、45 min檢測的 NOS活性逐漸升高，各測量值之間有著顯著性差異（均P＜0.05），試驗組在第5 min，15 min，25 min，35 min和45 min測量結果和對照組相比有著顯著性差異（均P＜0.05）。

2.3 SNP對ITP模型小鼠ROS濃度的影響

如表3所示，ROS濃度在PBS對照組中各測量值之間無顯著性差異（均P＞0.05），而SNP組在第5 min，15 min，25 min，35 min和45 min檢測的ROS濃度逐漸升高，各測量值之間有著顯著性差異（均P＜0.05），試驗組在第5 min，15 min，25 min，35 min和45 min測量結果和PBS對照組相比有著顯著性差異（均P＜0.05）。

表1 SNP對ITP模型小鼠NO含量的影響檢測結果（±s，單位：μmol／L）用藥時間5 min 15 min 25 min 35 min 45 min SNP組 16.70±2.53△ 19.12±3.52△ 25.44±2.08△ 29.85±5.21△ 32.47±6.28△PBS對照組 7.44±2.85 7.43±2.04 7.19±1.89 7.83±2.19 7.88±1.32 SNP組和PBS對照組相比，△P＜0.05；下同。

表2 SNP對ITP模型小鼠NOS活性的影響檢測結果（±s，單位：U／ml）用藥時間5 min 15 min 25 min 35 min 45 min SNP組 0.806±0.120△ 1.058±0.262△ 1.427±0.243△ 1.824±0.320△ 2.041±0.288△PBS對照組 0.413±0.088 0.461±0.057 0.454±0.032 0.420±0.014 0.484±0.051

?

2.4 ROS濃度與NO含量的相關性分析

ITP模型小鼠外周血ROS濃度與NO含量在加入藥物硝普鈉后第5 min，15 min，25 min，35 min和45 min均上升，如圖1所示。在用藥后ROS濃度變化與NO含量呈正相關（r＝0.76，P＜0.01）。

2.5 ROS濃度與NOS活性的相關性分析

ITP模型小鼠外周血ROS濃度與NOS活性在加入藥物硝普鈉后第5 min，15 min，25 min，35 min、45 min均上升，如圖2所示。在用藥后ROS濃度變化與NOS活性呈正相關（r＝0.82，P＜0.01）。

3 討論

圖1 NO含量和ROS濃度隨著用藥后不同時間的變化趨勢

特發性血小板減少性紫癜是一種獲得性器官特異性自身免疫性疾病，臨床治療上以糖皮質激素及免疫抑制劑為主，但其發病機制尚未完全清楚。本課題組曾用流式細胞儀檢測急性ITP患者外周血PAIgG和Tr細胞的數量，發現PAIgG含量明顯升高，而Tr細胞的數量明顯降低［3］。另外一些細胞因子也參與了該病的病理過程，如IL－7水平升高在AITP發病中具有重要作用，機制為降低有效免疫抑制作用，導致自身反應性T細胞激活增多、凋亡減少，促進了血小板破壞［4］。我們前期研究發現，在Jurkat系T腫瘤細胞中，在沒有外在改變腫瘤細胞一氧化氮合酶（NOS）的前提下，隨著過氧化物酶體增生物激活受體γ（PPAR－γ）的活化劑曲格列酮作用時間的延長，腫瘤細胞NO含量相應地增長［5］，隨后我們以特發性血小板減少性紫癜（ITP）模型小鼠為研究對象，發現曲格列酮以一種時間依賴的形式增加該模型小鼠血清中一氧化氮的含量，NO信號途徑在PPAR－γ的免疫調節功能中起到了一定的作用［6］。

急性期血栓性血小板減少性紫癜（TTP）的血漿能夠誘導人類單核細胞的ROS的產生，增強中性粒細胞CD11b的表達，血液中吞噬細胞的激活可能參與TTP的病理生理過程［7］。Ruiz－Torres MP發現內皮損傷是導致血栓性微血管病（TMA）事件中的核心因素，在該疾病的急性相中性粒細胞釋放過量的活性氧，參與了血栓性微血管病的釋放［8］。另外TNF－α能夠顯著增強免疫球蛋白誘導純化的嗜中性粒細胞中ROS的釋放［9］。在自身免疫性血小板減少癥中，鐵離子可以誘導活性氧（ROS）的生成，鐵超載導致ROS的產生過剩［10］，而高濃度活性氧也可能對腫瘤細胞有抑制和殺傷作用［11］。

圖2 NOS活性和ROS濃度隨著用藥后不同時間的變化趨勢

綜上所述，氧化應激和自由基可能在慢性ITP的發病過程中起到重要作用，但至今尚未見相關文獻報道。而本研究發現在慢性ITP小鼠模型中，外用NO供體藥物硝普鈉后，其外周血中ROS水平明顯升高，且有時間依賴性，另外NO、NOS均與ROS呈正相關，提示ROS在ITP病理發展中可能與NO具有協同作用，該效應可能會加重血小板的破壞過程，導致病情的進一步惡化發展，NO／NOS、ROS的檢測對慢性ITP的診治具有潛在的臨床指導意義。

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［4］金呈強，劉 仿，宋麗，等.急性ITP患兒外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Tr細胞、IL－7水平變化及意義［J］.山東醫藥，2009，49（11）：4.

［5］金呈強，劉 仿，肖 紅，等.活化的PPAR－γ對Jurkat系T腫瘤細胞 NO生成誘導的研究［J］.中國免疫學雜志，2008，24：6.

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