葡萄籽中多酚類化合物對口腔致病菌的抑制作用

張 卉， 吳大茹， 尤曉娟， 陳莉娜*

（1.西安交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061；2.美國伊利諾伊大學(xué) 芝加哥分校牙科醫(yī)學(xué)院，芝加哥60612）

葡萄籽提取物（Grape seed extract，GSE）是目前風(fēng)靡世界的一種食品添加劑和保健品。在美國、日本和歐洲，GSE成為人們?nèi)粘Ｉ钪凶畛Ｊ褂玫奶烊槐＝∑罚悄壳懊绹烊恢参锾崛∥?0大暢銷品種之一。在日本的年銷量達(dá)到每年100 000 kg[1]，具有巨大的市場潛力和開發(fā)價值。GSE的最大功用在于其中富含多酚類化合物，其中花青素類是目前為止發(fā)現(xiàn)的最高效的氧自由基清除劑，具有極強(qiáng)的抗氧化作用，其抗氧化活性為維生素E的50倍、維生素C的20倍，它能有效清除人體內(nèi)多余的自由基，具有超強(qiáng)的延緩衰老和增強(qiáng)免疫力的作用，被廣泛應(yīng)用于治療心血管疾病、癌癥、眼科疾病以及化妝品等領(lǐng)域[2-6]。然而對于其中多酚類化合物（包括原花青素以及其它多酚）的抗菌作用的研究報道較少，特別是應(yīng)用于口腔健康領(lǐng)域的研究并不多見。但是已有研究表明，GSE中的多酚類成分具有抑制口腔致病菌的作用，法國的Bonnaure-Mallet Martine等發(fā)明了以原花青素低聚體或單體為活性成分（≥1%）治療牙周病的制劑[7]，并獲得了專利保護(hù)。因此，在美國伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校牙科醫(yī)學(xué)院的資助下，作者進(jìn)行了GSE中多酚類化合物對口腔致病菌的抑制作用的研究。

1 材料與方法

1.1 葡萄籽提取物

實(shí)驗(yàn)中使用的葡萄籽提取物來源于美國Polyphenolics公司（Madera，CA 93639，USA）。

1.2 微生物及培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)中使用的口腔致病菌包括致齲病菌變異鏈球菌 Streptococcus mutans（ATCC 10449）和戈登鏈球菌（Streptococcus gordonii challis）以及牙周病菌具 核 梭 桿 菌 Fusobacterium nucleatum（ATCC 10953），這些菌種均保存于美國伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校牙科醫(yī)學(xué)院的菌種庫中。實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基包括腦心浸液培養(yǎng)基（Difco，Sparks，MD） 和厭氧培 養(yǎng) 基 （Oxoid Ltd，Basingstoke，Hampshire，England）。培養(yǎng)條件為37℃，于普通培養(yǎng)箱（對于變異鏈球菌和戈登鏈球菌）或厭氧培養(yǎng)箱（對于具核梭桿菌）中培育 24～48 h。

1.3 試劑

實(shí)驗(yàn)中使用的色譜填料有:大孔樹脂HP-20，購 于 Supelco 公 司 （Bellefonte，PA，USA）；Sephadex LH-20，購于GE Healthcare公司。其它化學(xué)試劑均購于 Fisher公司（Fair Lawn，NJ，USA）。

1.4 儀器

光密度測試使用Power Wave 200微板掃描分光光度儀 （Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT，USA）。

1.5 最小抑制濃度法（MIC Assay）

在96孔微量滴定板中加入待測試的樣品溶液和相應(yīng)的培養(yǎng)基。取相應(yīng)的測試菌株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)（12 h）后，將培養(yǎng)液離心（10 000 r/min，10 min），吸取上層清液并用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.8）洗滌兩次，而后將菌落混懸于PBS中。測試菌落混懸液的光密度值（OD），并對其進(jìn)行相應(yīng)的稀釋，將混懸液加入已經(jīng)準(zhǔn)備好的96孔微量滴定板中，使其終濃度達(dá)到5×105（變異鏈球菌和戈登鏈球菌）或5×106（具核梭桿菌）CFU/mL。陰性對照組加入與測試樣品溶液等體積的生理鹽水，陽性對照組加入葡萄糖酸洗必泰溶液 （chlorhexidine gluconate，CHX），其對于3種細(xì)菌的MIC值分別為1.25 μg/mL（變異鏈球菌）、2.5 μg/mL（戈登鏈球菌）和 2.5 μg/mL（具核梭桿菌）。所有的培養(yǎng)平板均置于37℃相應(yīng)的培養(yǎng)箱（普通培養(yǎng)箱用于培養(yǎng)變異鏈球菌和戈登鏈球菌，厭氧培養(yǎng)箱用于培養(yǎng)具核梭桿菌）中，培養(yǎng)24～48h。而后將培養(yǎng)平板置于光密度測試儀上讀取培養(yǎng)液的OD值。通過比較OD值的大小判斷微生物的生長情況，OD越大說明微生物生長越多，從而推測被測組分的最小抑制濃度。

1.6 GSE的分離

將60 g葡萄籽提取物溶解于300 mL蒸餾水中，加樣于大孔吸附樹脂柱，分別以水、20%，40%，60%，80%系列體積分?jǐn)?shù)的甲醇/水和純甲醇依次洗脫，分為6個組分，分別記為PA-1～PA-6。對這些組分的MIC進(jìn)行測試后發(fā)現(xiàn)PA-1的最小抑制濃度較其它各組分為低，因而對其采用Sephadex LH-20柱色譜進(jìn)行了進(jìn)一步的分離，分別以10%，15%，20%，30%，50%，80%，90%系列體積分?jǐn)?shù)甲醇/水和純甲醇進(jìn)行洗脫，獲得13個組分，分別標(biāo)記為PA-1-1～PA-1-13。繼續(xù)采用MIC進(jìn)行活性追蹤，對PA-1-7采用硅膠柱色譜分離，以V（甲苯）∶V（丙酮）∶V（乙酸）=5∶1∶0.1 和 3∶1∶0.1 作為流動相，獲得化合物1（沒食子酸）；對PA-1-10采用硅膠柱色譜分離，以 V（甲苯）∶V（丙酮）∶V（乙酸）=3∶1∶0.1 和 3∶3∶0.1作為流動相，獲得化合物3（原兒茶酸）；對PA-1-11采用Sephadex LH-20柱色譜進(jìn)行分離，以體積分?jǐn)?shù)75%、80%甲醇/水及純甲醇為流動相，獲得化合物2（鄰苯三酚）；對PA-1-12采用硅膠柱色譜分離，以V（甲苯）∶V（丙酮）∶V（乙酸）=3∶1∶0.1，3∶3∶0.1，3∶5∶0.1和 3∶7∶0.1作為流動相，獲得化合物 4（表兒茶素）。

2 結(jié)果與討論

2.1 活性追蹤分離獲得的4種多酚類化合物結(jié)構(gòu)確證

化合物 1:白色針晶（丙酮），1H NMR （360 MHz，DMSO-d6） δH 6.95 （2H，s，H-2 及 H-6）；13C NMR（80 MHz，DMSO-d6）δc109.6 （C-2 及 C-6），121.4（C-1），138.9（C-4），146.4（C-3 及 C-5），168.5（C-7）；HR-ESIMS:m/z 169.0139 [M-H]-（C7H6O5，calcd 169.014 2）。通過波譜解析并與文獻(xiàn)對比[8]，確定其為沒食子酸。

化合物 2:白色針晶（丙酮），1H NMR（360 MHz，DMSO-d6） δH6.27 （2H，d，J=7.2 Hz，H-4 及 H-6），6.45（1H，dd，J=8.5，8.5 Hz，H-5）；13C NMR（80 MHz，DMSO-d6） δc108.0 （C-4 及 C-6），119.4 （C-5），134.0 （C-2），147.2 （C-1 及 C-3）；HR-ESIMS:m/z 125.0238[M-H]-（C6H6O3，calcd 125.022 6）。 通過波譜解析并與文獻(xiàn)對比[8]，確定其為鄰苯三酚。

化合物 3:白色針晶（丙酮），1H NMR（360 MHz，acetone-d6） δH6.89 （1H，d，J=8.2 Hz，H-5），7.47（1H，dd，J=8.2，2.0 Hz，H-6），7.52 （1H，d，J=2.0 Hz，H-2）；13C NMR （80 MHz，acetone-d6） δc115.3 （C-5），117.1（C-2），123.2（C-6），124.5（C-1），141.6（C-3），146.5 （C-4），159.7 （C-7）；HR-ESIMS:m/z 153.0185[M-H]-（C7H6O4，calcd 153.017 2）。 通過波譜解析并與文獻(xiàn)對比[8]，確定其為原兒茶酸。

化合物 4:白色粉末（甲醇），1H NMR（360 MHz，acetone-d6） δH2.49 （1H，dd，J=16.1，8.7 Hz，H-4axi），2.89 （1H，dd，J=16.1，5.6 Hz，H-4eq），3.96（1H，m，H-3），4.51 （1H，d，J=7.9 Hz，H-2），5.85（1H，d，J=2.3 Hz，H-8），6.00（1H，d，J=3.2 Hz，H-6），6.72（1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-6’），6.78（1H，d，J=8.1 Hz，H-5’），6.88 （1H，d，J=1.9 Hz，H-2’）；13CNMR （80 MHz，acetone-d6） δc27.8 （C-4），67.2（C-3），81.6（C-2），94.1（C-8），95.0（C-6），99.4（C-4a），114.2（C-2’），114.5（C-5’），118.8（C-6’），130.8（C-1’），144.6（C-3’），144.7（C-4’），155.7（C-8a），156.2（C-5），156.7（C-7）；ESIMS m/z 288[M-H]-。通過波譜解析并與文獻(xiàn)對比[9]，確定其為表兒茶素。

如圖1所示。

圖1 葡萄籽提取物經(jīng)活性追蹤分離獲得的4種多酚類化合物結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemicalstructures of the 4 polyphenol compounds isolated from GSE with bioactivity guide

2.2 葡萄籽提取物不同極性部分的抑菌活性

葡萄籽提取物經(jīng)大孔吸附樹脂柱分離后，水洗部分（PA-1）對所測試的3個菌種的最小抑制質(zhì)量濃度分別為0.5 mg/mL（變異鏈球菌）、2 mg/mL（戈登鏈球菌）和0.25 mg/mL（具核鏈球菌），相對于其它醇洗部分具有較好的抑菌活性（見表1）。由此可以推測葡萄籽提取物中的極性較大，在大孔吸附樹脂柱上容易被水洗脫的化合物（初步推斷為多酚類化合物）具有良好的抑制致齲病菌和牙周病菌的作用。

2.3 大極性部分中不同分子量部分的抑菌活性

將PA-1部分于葡聚糖凝膠色譜柱上進(jìn)行進(jìn)一步的分離后，對所獲得的組分進(jìn)行了抑菌活性測定。結(jié)果表明，洗脫流分PA-1-11對所測試的3個菌種具有較好的抑制活性，最小抑制質(zhì)量濃度分別為 0.125 mg/mL（變異鏈球菌）、0.25 mg/mL（戈登鏈球菌）和 0.031 25 mg/mL（具核梭桿菌）（見表 2）。 由于葡聚糖凝膠色譜柱主要是依照分子量大小進(jìn)行分離的，因此可以推測產(chǎn)生較好抑菌效果的并非具有較大分子量的花青素類化合物，而是一些小分子多酚類化合物，這也與法國學(xué)者的研究結(jié)果相一致[7]。

表1 PA-1～PA-6對3種口腔致病菌的最小抑制濃度 mg/mLTable 1 MIC of fraction PA-1 to PA-6 against 3 kinds of periodontitis or cariogenic bacterial

表2 PA-1-1～PA-1-13對三種口腔致病菌的最小抑制濃度 mg/mLTable 2 MIC of fraction PA-1-1 to PA-1-13 against 3 kinds of periodontitis or cariogenic bacterial

2.4 幾種小分子多酚類化合物的抑菌活性

根據(jù)上述活性測試的結(jié)果，對抑菌活性較強(qiáng)的PA-1-7、PA-1-10、PA-1-11 和 PA-1-12 進(jìn)行了進(jìn)一步硅膠柱色譜的分離，獲得化合物1～4，并測定了它們對致齲病菌和牙周病菌的最小抑制質(zhì)量濃度（表3）。由結(jié)果可知，化合物2，即鄰苯三酚，對致齲病菌和牙周病菌的抑制作用最強(qiáng)，其次是化合物1（沒食子酸）。這兩個化合物均含有3個鄰位酚羥基，提示這一結(jié)構(gòu)對于口腔致病菌的抑制作用最強(qiáng)，而羧基的引入（化合物1）不僅沒有增加抑菌活性，反而有所減弱。化合物3僅含有2個鄰位酚羥基，并具有羧基，其抑菌作用大大降低。化合物4（表兒茶素）作為花青素類化合物的基本結(jié)構(gòu)單元，對牙周病菌具有一定的抑制活性，但對致齲病菌作用較弱，進(jìn)一步證實(shí)了花青素類成分抗菌活性較差的推斷。

表3 化合物1～4對三種口腔致病菌的最小抑制濃度Table 3 MIC （mg/mL） of comp.1-4 against 3 kinds of periodontitis or cariogenic bacterial mg/mL

3 結(jié)語

綜上所述，可以推斷葡萄籽提取物對于保護(hù)口腔健康是非常有利的，而其中能夠抑制致齲病菌和牙周病菌的化學(xué)成分并非抗氧化活性較好的且具有較高聚合度的花青素類化合物，而是其低聚物、單體或分子量更小的多酚類化合物，其中以含有鄰苯三酚結(jié)構(gòu)的化合物抑菌活性最佳，當(dāng)酚羥基減少或結(jié)構(gòu)中增加羧基時，抑菌活性降低，其中酚羥基數(shù)目的影響大于羧基的影響。

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