丙烯酰胺樣品前處理及其檢測方法研究進展

孫秀蘭， 紀 劍， 安 璐， 張銀志

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

丙烯酰胺 （acrylamide），是一種有毒的無色、無味透明固體結晶，沸點為125℃，熔點為84～85℃，室溫下穩定，熔融或暴露在紫外光下以及氧化條件下易發生聚合反應產生聚丙烯酰胺。動物實驗和體外實驗證明，丙烯酰胺可導致遺傳物質改變和癌癥。其主要源于薯條薯片，炸透的薯片中丙烯酰胺含量高達12 800 μg/kg。JECFA根據各國丙烯酰胺攝入量，認為人平均攝入量約 0.001 mg/（kg·d）[1]。 且我國將食品中丙烯酰胺的檢驗列為“十五”國家重大科技專項“食品安全關鍵技術”課題，衛生部食品安全計劃也將食品中丙烯酰胺檢測方法的建立和我國食品丙烯酰胺分布調查作為一個重要內容。目前食品中丙烯酰胺的測定方法主要采用色譜法，尤其是色質聯用技術大大提高了測定的靈敏度和準確度，已成為國際關注的檢測技術。作者就近年來國內外應用較多、有良好前景的樣品前處理及檢測方法作一簡要綜述。

1 丙烯酰胺樣品前處理技術

食品中丙烯酰胺的分析通常需經過樣品提取、純化富集、分離檢測等步驟，樣品前處理是核心，它對保證測定結果的準確性和可靠性、提高檢測效率具有重要的影響，主要包括提取、衍生和凈化等步驟。提取指使用適當溶劑將待測物連同樣品基質從固態樣品中轉移至易于凈化和分析的液態；凈化指將待測物與提取液中的干擾物質分離，在有些方法中提取和凈化一步完成，而對于某些復雜樣品，提取后往往還需凈化才能達到待測物與干擾雜質分離。另外，一些檢測方法需要將樣品衍生化，從而改善丙烯酰胺的分離度和靈敏度。

1.1 液-液萃取

水是目前應用最廣泛的萃取溶劑，因為丙烯酰胺在水中的溶解度最大，對于大多數食品樣品萃取完全。丙烯酰胺在酸性溶液中更加穩定，美國FDA建議用含體積分數0.1%的蟻酸水溶液萃取樣品[2]。而且為了追求樣品的高回收率和避免樣品前處理過程中乳化現象產生，經常在萃取前加入一定量的NaCl水溶液，以達到破乳的目的[3]。近年來加速溶劑萃取（ASE）的方法被廣泛地應用于復雜樣品的前處理過程，其突出優點是溶劑用量少、快速、基體影響小、萃取效率高、選擇性好[4]。

王海波[5]以10 mmol/L甲酸溶液與乙腈體積比7∶3混合為提取溶液，精密稱取待測丙烯酰胺樣品5 g，加提取溶液50 mL使充分溶解混勻，室溫30℃下振蕩1 h后取出靜置10 min以沉淀不溶物質。取上清液 5 mL，經過 0.22 μm尼龍濾膜和 On Guard RP柱過濾，濾液直接上機分析。對于脂肪含量高的樣品，可采用有機溶劑萃取。

加速溶劑萃取技術 （ASE）是一種在提高溫度（50～200 ℃）和壓力（10.3～20.6 MPa）的條件下，利用有機溶劑萃取固體或半固體的樣品前處理方法。其優點是溶劑用量少、快速、基體影響小、選擇性好、萃取效率高。Cavalli[6]等人以水作為提取溶劑，采用加速溶劑萃取技術得到MS的檢測限為10～1 000 μg/mL。同時瑞士公共安全部門也提出了采用ASE提取食品中的丙烯酰胺的方法。

1.2 固相微萃取

固相微萃取（SPME）是集采集、萃取、濃縮、進樣于一體的樣品處理新技術，可與GC-MS、HPLCMS等聯用[7]。近年來在食品中揮發性有機物的檢測方面得到了廣泛應用。分子印跡技術是根據模板分子與聚合物單體接觸時會盡可能地同單體形成多重作用點，通過聚合，把這些多重作用點固定或“凍結”，當模板分子除去后，聚合物中就形成了與模板分子在空間和結合位點上相匹配的具有多重作用點的空穴，這樣的空穴對模板分子具有選擇性。

權英[8]等以丙烯酰胺的結構類似物丙酰胺為模板分子，采用本體聚合法制備出了對丙烯酰胺具有較好選擇性的印跡聚合物。靜態吸附平衡實驗和Scatchard分析結果表明，與非印跡聚合物相比，印跡聚合物對丙烯酰胺具有較強的吸附特性，最大吸附量為4.283 mg/g。JIANG Dong-lei[9]通過在硅膠表面構建的丙烯酰胺分子印跡物（MIP）作為填充材料自制SPE柱，進行丙烯酰胺樣品前處理。制備的MIP-SPE小柱用于薯條樣品前處理，平均回收率為93.5%，RSD值為2.24%。與C18-SPE柱的特異性吸附比較，其制備的MIP-SPE柱具有極好的選擇性，通過與HPLC的結合，可用于食品樣品中丙烯酰胺的快速檢測。JI Jian[10]通過表面引發原子自由基聚合在石墨烯表面構建丙烯酰胺分子印跡物，印跡物的吸附能力為123.48 μmol/g，應用于薯條樣品前處理，平均回收率為93.7%，RSD值為4.71%。

2 丙烯酰胺檢測方法

由于食品的組成成分復雜，而且丙烯酰胺的含量很低，國外普遍采用的食品中丙烯酰胺的分析方法主要有氣相色譜法、液相色譜法，特別是液相色譜-串聯質譜法 （LC-MS/MS）等檢測方法，準確性和靈敏性均相應提高，是具有潛在發展前景的檢測方法。

2.1 氣相色譜-質譜聯用法 （GC-MS）

由于丙烯酰胺的熱不穩定性，采用GC進行檢測時，需要對其進行化學衍生，以改善丙烯酰胺的熱不穩定性，提高GC檢測方法的靈敏度與專一性。目前，衍生化方法主要為溴化衍生，衍生產物為2，3-二溴丙酰胺或是2-溴丙烯酰胺[11]。

程劼[12]通過氣相色譜-串聯四極桿質譜 （GCMS/MS）結合兩步衍生法檢測經樣品前處理的丙烯酰胺樣品。采集的樣品經正己烷萃取，10 000 r/min轉速離心，過濾，濾液通過C18 SPE凈化淋洗。凈化后的丙烯酰胺樣品通過KBr，HBr和飽和溴水進行初步衍生化，然后滴加硫代硫酸鈉至衍生液褪色，通過乙酸乙酯萃取，過濾。色相色譜條件:TR-5毛細管氣相色譜柱，柱溫程序:起始溫度70℃，保持1 min，以 15℃/min的速率升溫至 280℃，保持10 min；進樣量1 μL。四級桿串聯質譜條件:采用離子反應監測模式 （SRM），檢測定性離子對m/z 152＞135和 m/z 152 ＞107，定量離子 m/z 152 ＞135，碰撞氣體氬氣能量15 eV。其在3.0～30 ng/g質量分數內呈現良好的線性關系，丙烯酰胺的檢出限 （LOD）為1.0 ng/g（S/N=3）。郭志峰[13]建立了一種測定市售鍋巴中的丙烯酰胺含量的方法。該法樣品前處理不必經過溴化衍生，樣品脫脂后用水提取丙烯酰胺，提取液過活性炭柱，再用乙酸乙酯將活性炭柱中吸附的丙烯酰胺洗脫，洗脫液濃縮后經氣相色譜-質譜（GC-MS）定量分析，檢測限 （LOD）為 0.06 mg/kg。

2.2 液相色譜-串聯質譜法 （LC-MS/MS）

由于GC測定樣品中丙烯酰胺需進行溴化衍生，操作繁瑣，對衍生技術要求較高，難以掌握。采用LC方法不需要衍生，直接對丙烯酰胺進行測定，簡化了分析過程，而且測定在常溫下進行，克服了熱不穩定性[14]。

程江華[15]通過液相色譜-串聯質譜法 （LC-MS/MS）測定食品樣品中的丙烯酰胺含量，采用的色譜柱為 Atlantis TM C18，質譜條件為ESI+模式，毛細管電壓2.5 kV，丙烯酰胺定性離子（72/55），碰撞能量5 eV。其平均回收率為92.73%，RSD為1.46%，檢測范圍 25～1 600 ng/mL，檢出限（LOD）9.0 ng/mL（S/N=3）。Renzo Bortolomeazzi[16]通過 SPE 柱（填充物:自制C18材料、強陽離子（SCX）和陰離子交換（SAX）吸附劑）對咖啡樣品進行前處理，液相色譜-串聯質譜法 （LC-MS/MS）測定丙烯酰胺含量。通過氘d3標記的丙烯酰胺做內標，對6種咖啡樣品進行測定，其RSD值為5%，最低檢出限 （LOD）為5 μg/kg，定量限 （LOQ） 為 16 μg/kg。

2.3 高效液相色譜 （HPLC-CWO）和氣相色譜（GC-μECD）分析方法

已有報道利用氣相色譜-質譜聯用法 （GCMS），和液相色譜-串聯質譜法 （LC-MS/MS） 測定食品中的丙烯酰胺，兩種方法對儀器的要求都很高，不適合在普通實驗室中推廣。

張輝珍[17]建立了食品中丙烯酰胺的高效液相色譜 （HPLC-CWO） 和氣相色譜 （GC-μECD） 分析方法。其優化了前處理步驟和儀器分析條件，HPLC分析方法采用體積分數0.1%甲酸溶液提取，石墨化碳黑固相萃取小柱凈化，甲醇和乙酸銨 體積比5∶3作為流動相測定，其最低檢出限（LOD）為0.01 mg/kg，定量限 （LOQ）為0.05 mg/kg。GC-μECD法則是在強酸體系中，用0.1 mol/L KBrO3和KBr對丙烯酰胺進行加成反應衍生化，乙酸乙酯提取衍生化產物α，β-二溴丙酰胺，用HP-FFAP毛細管柱分離，電子捕獲檢測器檢測，最低檢出限（LOD）0.005 mg/kg，定量限（LOQ）為 0.02 mg/kg。

2.4 離子色譜-質譜聯機檢測法

王海波[5]建立了使用離子色譜串聯質譜測定食品中丙烯酰胺離子的檢測方法。樣品經過前處理后，通過離子排斥色譜進行分離，質譜進行定性并進行定量計算。以IonPac AS1分析柱進行離子排斥分離。ESI-MS以選擇離子模式對目標離子進行監控，以SIM離子72的峰面積進行定量計算。該方法對丙烯酰胺的檢出限（S/N=3）為 5 μg/L，丙烯酰胺在2～100 μg/L質量濃度范圍內具有良好的線性，線性相關系數r=0.999 6。程喜明[18]通過使用離子色譜測定油炸食品中丙烯酰胺，樣品前處理方法與FDA提供的方法大致相同。經超聲、離心后上清液用離子色譜-紫外檢測器檢測，通過IonPac ICEAS1（4 mm×250 mm） 分離柱，IonPac NG1 （2 mm×250 mm）保護柱，紫外檢測波長為202 nm。結果表明其對3種樣品的加標回收率在80%以上，RSD＜5%，最低檢出限（LOD）為0.010 mg/kg，相對偏差＜20%。

3 前景展望

不同的前處理技術有其各自的適用范圍和優缺點，在實際工作中，應根據待測樣品的種類和基質、測定結果要求和檢測儀器的不同，并結合實際條件選用合適的樣品前處理方法。固相微萃取、加速溶劑萃取、基質固相分散等新技術具有廣泛的應用空間。

目前食品中丙烯酰胺的衛生標準尚未建立，各國正廣泛開展食品中丙烯酰胺的研究，嘗試了多種方法測定食品中丙烯酰胺，見諸報道的有氣相色譜法（GC），液相色譜法（LC），氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS），液相色譜-串聯質譜法 （LC-MS/MS）等，但是這些方法在分析時間、成本及普及性方面各有長短，其最大的問題在于儀器昂貴，樣品前處理方法復雜繁瑣，成本高，不利于在我國普及。食源性接觸丙烯酰胺對人類健康的影響與分析方法和分析數據的可靠性有直接的關系，食品中痕量丙烯酰胺的檢驗重點是做好樣品前處理和檢測方法的選擇。鼓勵新型的檢測方法，諸如靶細胞分析定量，DNA損傷測定等生物傳感技術應用于丙烯酰胺的定量和定性分析檢測中。

[1]Anna C Vikstrom.In vivo doses of acrylamide and glycidamide in humans after intake of Acrylamide-Rich food[J].Toxicological Sciences，2011，119（1）:41-49.

[2]FDA.Detection and quantitation of acylamide in foods[M].[S.I.]:US Food and Drug Administration，2002.

[3]Young M S，Jenkins K M．Solid-phase extraction and cleanup procedures for determination of acrylamide in flied potato products by liquid chromatography/mass spectrometry[J].Journal of AOAC International，2004，87:961-964．

[4]張齊，蔡明招，朱志鑫.食品中丙烯酰胺分析的樣品前處理技術[J].食品科技，2006（7）:222.ZHANG Qi，CAI Ming-zhao，ZHU Zhi-xin.Overview on sample preparation technique for the determination of acrylamide in foods[J].Food Science and Technology，2006（7）:222.（in Chinese）

[5]王海波.離子色譜柱-質譜聯用測定食品中丙烯酰胺[Z].[S.I.]:戴安中國有限公司應用研究中心，2011.

[6]Cavallli S，Maurer R，Hoeflter F，et al.Fast etermination of acrylamide in food samples using accelerated solvent extraction followed by ion chromatography with UV or MS detection[J]．LC-GC International，2003，16:9-11.

[7]Anthony F L，Feiter M A.Silylation of acrylamide for analysis by Solid-Phase Microextraction/Gas chromatography Ion-TrapMass spectrometry[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry，2004（12）:3744-3748.

[8]權英，孫靜，沈陽，等.丙烯酰胺分子印跡聚合物的制備及其性能研究[J].食品與發酵工業，2010，11（36）:276.QUAN Ying，SUN Jing，SHEN Yang，et al.Study on preparation and performances of acrylamide molecularly imprinted polymers[J].Food and Fermentation Industries，2010，11（36）:276.（in Chinese）

[9]JIANG Dong-lei，SUN Xiu-lan，ZHANG Yin-zhi.Preparation and application of acrylamide molecularly imprinted composite solid-phase extraction materials[J].Analytical Methods，2012（4）:3760.

[10]JI Jian，SUN Xiu-lan，TIAN Xiu-mei，et al.Synthesis of acrylamide molecularly imprinted polymers immobilized on graphite oxide through Surface-Initiated atom transfer radical polymerization[J].Analytical Letters，2012，46:969-981.

[11]Zhang Y，Dong Y，Ren Y，et al.Rapid determination of acrylamide contaminant in conventional fried foods by gas chromatography with electron capture detector[J].Joumal of Chromatography A，2006，1116:209-216.

[12]程劼，蘇曉鷗，張維，等.氣相色譜-串聯四極桿質譜測定餐廚廢棄物中的丙烯酰胺[J].中國農業科學，2012，45（16）:3373-3381.CHENG Jie，SU Xiao-ou，ZHANG Wei，et al.Determination of acrylamide in kitchen waste using gas Chromatography-Tandem mass spectrometry[J].Scientia Agricultura Sinica，2012，45（16）:3373-3381.（in Chinese）

[13]郭志峰，張麗霞，王家強，等.GC/MS測定鍋巴中丙烯酰胺含量[J].分析試驗室，2009，12（28）:91-93.GUO Zhi-feng，ZHANG Li-xia，WANG Jia-qiang，et al.Determination of acrylamide in crispy rice by GC/MS[J].Chinese Journal of Analysis Laboratory，2009，12（28）:91-93.（in Chinese）

[14]于萍.食品中丙烯酰胺檢測方法的研究進展[J].福建分析測試，2011（6）:21-23.YU Ping.Research progress of detection of acrylamide in food[J].Fujian Analysis&Testing，2011（6）:21-23.（in Chinese）

[15]程江華，王薇，廖華俊，等.LC-MS/MS法測定11種鮮切油炸馬鈴薯片中丙烯酰胺的含量[J].中國食品學報，2011，7（11）:176-179.CHENG Jiang-hua，WANG Wei，LIAO Hua-jun，et al.LC-MS/MS method for the determination of acrylamide in 11 varieties of fresh-cut fried potato chips[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2011，7 （11）:176-179.（in Chinese）

[16]Renzo Bortolomeazzi，Marina Munari，Monica Anese，et al.Rapid mixed mode solid phase extraction method for the determination of acrylamide in roasted coffee by HPLC-MS/MS[J].Food Chemistry，2012，135:2687-2693.

[17]張輝珍，馬愛國，孫永葉，等.食品中丙烯酰胺測定的前處理條件和色譜條件優化[J].食品科學，2008，4（29）:278-282.ZHANG Hui-zhen，MA Ai-guo，SUN Yong-ye，et al.Optimization of pretreatment and chromatographic methods in acrylamide determi[J].Food Science，2008，4（29）:278-282.（in Chinese）

[18]程喜明，高峰，付光亮，等.離子色譜法測定油炸食品中丙烯酰胺[J].現代儀器，2010（4）:35-37.CHENG Xi-ming，GAO Feng，FU Guangliang，et al.Determination of acrylamide in carbohydrate-rich fried food by ionchromatography[J].Modern Instruments，2008，4（29）:278-282.（in Chinese）