三種加工方式海帶中砷形態和含量的比較

趙夢醒， 劉 淇， 江志剛， 雷 敏， 曹 榮

（1.中國水產科學研究院 黃海水產研究所，山東 青島 266071；2.青島農業大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266109；3.山東出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266001）

砷元素普遍存在于自然界各種生物體及環境組分中，砷復雜的新陳代謝方式和生物積累導致這一元素有超過25種不同的形態，并且有廣泛的濃度范圍[1]。砷的毒性與其化合物的性質，尤其與砷元素的化合價有關[2]。許多砷化合物對動植物都有毒性，其中無機砷被證明是人類的致癌物，而有機砷的毒性較小[3]；砷化合物毒性由大到小的順序為:砷化氫＞三氧化二砷＞亞砷酸＞砷酸＞有機砷[4]。因此，在評價食品安全性時，食品中砷元素的形態是重要因素。

海藻是一種高纖維、高礦物質、低脂肪食品[5]。2002年，聯合國糧農組織（FAO）調查顯示，在亞洲，習慣上把海藻作為食品和藥品的天然來源，中國、日本、韓國、越南和印度尼西亞是海藻的最大消費區[6]。我國藻類加工品產量增長迅速，2010年比2007年增長42.78%。近幾年，我國海帶（Laminaria japonica）每年海水養殖產量占藻類海水養殖產量的一半以上[7-8]。海帶是提取海藻酸鹽等物質的重要原料，也有相當一部分海帶僅經過簡單預處理（如曬干）后直接進入市場供消費者食用，海帶在實際生產中主要以淡干海帶或鹽漬海帶為主。

海藻中的砷含量較高，一般在20～60 mg/kg（以干重計）之間[9]，2006年海藻中無機砷超標問題對海藻加工企業造成嚴重損失[10]。砷的毒性與其形態密切相關，很多學者采用高效液相色譜（HPLC）、離子色譜（IC）、毛細管電泳（CE）等分離技術，結合電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）、原子熒光光譜（AES）等檢測技術分析不同形態砷化合物[11-17]，但有關海帶加工過程中砷形態和含量的變化情況研究較少。因此，本實驗以不同加工方式的海帶為研究對象，采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法（HPLC-ICP-MS）測定海帶中的砷形態，并進行定量分析，為海帶加工品的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗原料 新鮮海帶 （Laminaria japonica），2011年5月采自山東榮成。將新鮮海帶按以下3種方式加工處理。

Ⅰ組，直接干燥組:鮮海帶沖洗后直接曬干，然后烘干粉碎至40目備用；

Ⅱ組，漂燙組:鮮海帶100℃漂燙2 min，自來水冷卻后曬干，最后烘干粉碎至40目備用；

Ⅲ組，漂燙-鹽漬-水洗組:鮮海帶100℃漂燙2 min，自來水冷卻，瀝水，鹽漬（無碘鹽質量分數）25%，鹽漬時間72 h），沖洗3次，自來水浸泡12 h，再沖洗3次后曬干，最后烘干粉碎至40目備用。

1.1.2 儀器 BSA 224S-CW型分析天平，德國Sartorius公司產品；MARS EXPRESS微波消解儀，美國CEM公司產品；7500cx型電感耦合等離子體質譜儀，美國Agilent公司產品；1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司產品；AFS-2201雙道氫化物發生原子熒光光度計，北京海光儀器廠產品；SA-10原子熒光形態分析儀，北京吉天儀器有限公司產品；Milli-Q超純水系統，美國Millipore公司產品；KQ5200DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；TGL-20B型離心機，上海安亭科學儀器廠產品；InoLab pH740型pH計，德國WTW公司產品；渦旋混合器，德國IKA公司產品。

Halmilton PRP-X100陰離子色譜柱 （10 μm，250 mm×4.1 mm），PEEK 管 （φ=0.18 mm）；0.45 μm水相微孔濾膜，天津市科億隆實驗設備有限公司提供。

1.1.3 試劑 標準品:亞砷酸根（AsⅢ）、砷酸根（AsⅤ）、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷膽堿（AsC）、砷甜菜堿（AsB），購于中國計量科學研究院；磷酸氫二銨（分析純），上海試劑二廠產品；甲酸（優級純），天津市光復精細化工研究所提供；硝酸（優級純），德國MERCK公司產品。

1.2 方法

1.2.1 海帶中總砷含量測定方法 準確稱取烘干后的海帶粉0.5 g（精確至0.001 g），放入微波消解罐中；加入5 mL HNO3，靜置30 min，將消解罐放入微波消解儀中，設定消解程序和參數（如表1所示）并消解；消解后用超純水定容至50 mL；用ICP-MS測定消解液中的總砷含量，同時測定試劑空白。

表1 微波消解操作程序Table 1 Operating program for microwave digestion system

1.2.2 海帶中無機砷含量測定方法 采用高效液相色譜-氫化物發生原子熒光聯用技術[18]。

1.2.3 砷形態測定方法

1）流動相的配制

20 mmol/L磷酸氫二銨:稱取2.6412 g磷酸氫二銨，加水溶解并定容至1 L。用質量分數10%甲酸調 pH 至 6.0（±0.1），0.45 μm 水相微孔濾膜過濾，超聲20 min脫氣。

2）標準溶液的配制

砷標準儲備液:亞砷酸根、砷酸根、一甲基砷、二甲基砷、砷膽堿（以下簡稱5種砷）及砷甜菜堿，用超純水配制每種標準儲備液的質量濃度為5 μg/mL，于4℃冰箱保存；

砷標準溶液:將5種砷的標準儲備液及砷甜菜堿標準儲備液逐級稀釋，以20 mmol/L（NH4）2HPO4溶液（pH 6.0）為介質，配制成質量濃度分別為5、10、20、40、100 ng/mL 的混合標準溶液。 利用 ICPMS色譜軟件計算色譜峰的積分面積，得到不同濃度梯度的砷形態標準曲線。

3）ICP-MS 工作條件

RF功率1 510 W；霧化器為同心霧化器，用PEEK管將色譜柱與霧化器的入口連接；霧化室溫度2℃；蠕動泵轉速12 r/min；采樣深度7.4 mm；載氣流量0.84 L/min；輔助氣流量0.31 L/min。

4）色譜條件

色譜柱:Halmilton PRP-X100陰離子色譜柱（10 μm，250 mm× 4.1 mm）；流動相:20 mmol/L 磷酸氫二銨，pH 6.0，等度洗脫；進樣體積 50 μL；體積流量1.0 mL/min。

5）樣品前處理

稱取0.1 g左右（精確至0.001 g）海帶粉，加入10 mL 20 mmol/L （NH4）2HPO4溶液（pH 6.0），渦旋混勻，超聲萃取40 min；8 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用0.45 μm濾膜過濾，此濾液即為樣品提取液。

1.2.4 樣品提取液中總砷含量測定方法 移取0.5 mL樣品提取液，加入1 mL硝酸，用超純水定容至10 mL。采用ICP-MS測定提取液中的總砷含量。

1.2.5 標準曲線繪制方法 對質量濃度分別為5、10、20、40、100 ng/mL 的 5 種砷混合標準溶液和砷甜菜堿標準溶液的砷形態進行HPLC-ICP-MS分析，以砷質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.6 數據處理 采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行 T-檢驗比較分析，結果用平均值±標準差（±s）表示。

2 結果與分析

2.1 海帶樣品中的總砷和無機砷含量

表2是不同加工方式海帶樣品的總砷和無機砷含量。從表中可知，無機砷含量占總砷含量的百分比小于1%；與直接干燥海帶相比，漂燙后海帶的總砷和無機砷含量均減少，無顯著差異（P＞0.05）；漂燙-鹽漬-水洗組海帶的總砷含量下降了45.75%，差異極顯著（P＜0.01）。海帶經鹽漬水洗后砷含量明顯減少，與孫建璋等[19]認為在熱燙、鹽漬過程中海帶含砷量降低的結論相一致。

表2 不同加工方式海帶樣品中總砷和無機砷含量Table 2 Contents of total arsenic and inorganic arsenic in kelps

2.2 海帶樣品中不同砷的形態及含量

2.2.1 標準曲線的繪制 圖1、2分別是40 ng/mL的5種砷混合標準溶液和砷甜菜堿標準溶液的色譜圖，線性回歸方程如表3所示，各種形態砷的線性回歸方程相關系數R≥0.999 8，在5.0～100.0 ng/mL范圍內具有良好的線性關系。

圖1 40 ng/mL 5種砷混合標準溶液HPLC-ICP-MS色譜圖Fig.1 HPLC-ICP-MS chromatogram of 40 ng/mL mixed standard solution

圖2 40 ng/mL AsB標準溶液HPLC-ICP-MS色譜圖Fig.2 HPLC-ICP-MS chromatogram of 40 ng/mL AsB standard solution

表3 不同形態砷的線性回歸方程Table 3 Linear regression equations of different arsenics

2.2.2 樣品分析 不同海帶樣品中的砷形態及含量如表4所示。結果表明，海帶中的砷主要以有機砷形態存在，包括3種未知砷化合物；直接干燥海帶中的已知砷形態為AsC、AsB、DMA和少量AsⅤ；與直接干燥海帶比較，漂燙海帶和漂燙-鹽漬-水洗海帶中的AsC含量明顯下降，差異顯著（P＜0.05），漂燙海帶中的As1和As2含量顯著下降（P＜0.01或P＜0.05），漂燙-鹽漬-水洗海帶中的砷化合物As1、As2 和 As3 含量下降明顯（P＜0.01 或 P＜0.05）；海帶經漂燙、鹽漬水洗后AsⅤ含量降低；含量毒性相對較大的AsⅢ在3種海帶樣品中均未檢出。海藻中的砷主要以有機形態存在，無機砷含量很低，約占總砷含量的5%以內[20-21]，李衛華等[22]、韋超[23]在海帶樣品提取液中均未檢出無機砷。高繼慶[24]采用氫化物發生原子熒光技術對干海帶、鹽漬海帶和鮮海帶（以濕重計）中的無機砷進行了測定，在扣除水分的影響后，鹽漬海帶中的無機砷含量下降，與本研究結果趨勢相一致。

表4 不同海帶樣品中砷形態及含量Table 4 Species and contents of arsenic in kelps

圖3是直接干燥海帶樣品的HPLC-ICP-MS色譜圖，通過保留時間可以判定，As1、As2、As3三種化合物均為有機砷。因此，海帶中的砷主要以有機砷形態存在。從表4可知，漂燙海帶中As1、As2與直接干燥海帶相比有明顯減少，而漂燙-鹽漬-水洗海帶中As1、As2、As3含量均有所下降，與海帶中總砷含量變化趨勢相一致，可見砷含量的減少主要是有機砷含量的減少。研究表明，海藻中砷化合物的主要形態是砷糖。孟昭宇[9]研究了水產品中不同價態的砷，發現海藻中砷糖是最主要的砷化物形態，與Toni Llorente-Mirandes等[17]檢測結果一致；李衛華等[22]研究發現海帶中的砷形態是砷糖PO4、砷糖OH、砷糖 SO3和 DMA；Rehema Tukai等[25]采用微波輔助提取、HPLC-ICP-MS技術檢測了褐藻中的砷形態包括砷糖PO4、砷糖OH、砷糖SO3及少量DMA、AsⅢ和MMA；韋超[23]對海帶樣品中砷形態進行了研究，在樣品提取液中檢測到砷糖PO4、砷糖OH、砷糖SO3和DMA，其中3種砷糖與本實驗中As1、As2、As3的出峰位置相似，據此推測這3種有機砷是砷糖。由于砷糖標準品沒有商品化，因此無法對砷化合物As1、As2、As3進行定性和定量。目前，已經有學者從天然物質中分離出砷糖作為標準品[22，25]，或者采用高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術測定未知砷化物的精確分子量[16]，以此來對砷糖進行定性。由于有機砷的C-As鍵結合牢固，在人體內不能分解和蓄積，毒性很低，基本以原形排除體外[26]，砷糖是海帶中的主要砷形態，因此未見有食用海帶而發生砷中毒的報道。

圖3 直接干燥海帶樣品的HPLC-ICP-MS色譜圖Fig.3 HPLC-ICP-MS chromatograms of direct drying kelp

圖4是3種海帶提取液中不同砷形態含量測定結果的比較。結果顯示，海帶提取液中3種砷糖化合物含量總和均占總砷含量的95%以上，因此對海帶的毒性影響較小；直接干燥海帶、漂燙海帶和漂燙-鹽漬-水洗海帶樣品的提取效率（提取液中總砷含量與樣品中總砷含量的比值）分別是88.59%、58.00%和29.95%，說明不同樣品用相同方法提取時，提取效率存在較大差異，與余晶晶等[27]、Slejkovec等[28]的研究結果一致。

圖4 海帶中不同形態砷含量結果Fig.4 Results of contents of arsenic in extract

3 結語

1）采用ICP-MS方法對不同加工方式的海帶進行總砷測定，直接干燥海帶、漂燙海帶和漂燙-鹽漬-水洗海帶的總砷含量分別為47.23、42.91 mg/kg和25.62 mg/kg；與直接干燥海帶相比，漂燙后海帶總砷含量下降9.15%；漂燙-鹽漬-水洗海帶總砷含量下降45.75%。

2）通過對海帶加工過程中砷形態和含量的比較，HPLC-ICP-MS色譜圖顯示，直接干燥海帶和漂燙海帶中含有砷膽堿、砷甜菜堿、二甲基砷和少量五價無機砷；漂燙-鹽漬-水洗海帶中含有砷膽堿、二甲基砷、少量一甲基砷和五價無機砷；3種不同加工方式海帶中均含有3種砷糖化合物，其質量約占總砷質量的95%以上，無機砷所占比例小于總砷質量的1%。

3）隨著漂燙或鹽漬水洗次數的增加，海帶中總砷含量下降，且3種砷糖化合物對總砷含量的降低起主要作用。因此，在直接食用或加工海帶時可進行漂洗或水洗，以減少海帶砷的攝入量。

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