分子病理學在骨腫瘤診斷中的應用進展

許 猛 綜述 王 巖 審校

解放軍總醫院 骨科，北京 100853

隨著腫瘤遺傳學的進步，特異基因的改變已經在病理實驗室的日常診斷中得以應用。因此，分子診斷在骨腫瘤的分型中發揮著越來越重要的作用。研究表明，所有尤文氏肉瘤和近70%的低分化動脈瘤樣骨囊腫都有染色體易位，包括EWSR1基因或USP6(TRE17)基因等。而對于骨肉瘤和高分化軟骨肉瘤，基因組的不穩定和復雜基因組型的參與也是導致發病的最關鍵環節。現已被證實的前列腺癌中基因融合的高發生率(79%)啟示在骨腫瘤中存在更多隱性染色體失常[1]。最近確定了兩個新發現的復雜融合產物：間葉軟骨肉瘤HEY1-NCOA2融合基因； 上皮樣血管內皮瘤中t(1；3)(p36；q25)易位導致的WWTR1-CAMTA1融合，包括骨[2-5]。本綜述將介紹多種用于探索骨腫瘤基因改變的技術，并評論一些現存的骨腫瘤不同基因亞型的分型標準。

1 檢測細胞遺傳學變異的分子技術

1.1 傳統顯帶和多色熒光原位雜交技術 依賴增殖細胞中期技術，傳統的細胞遺傳學研究曾是探索復雜染色體改變的重要探索工具。人染色體核型分析為腫瘤相關基因結構和數量的改變提供了全基因掃描。這些試驗適用于探索未知的遺傳物質改變，這些改變轉而實現了特征識別以及腫瘤相關染色體重排。例如復雜易位已被用于標示斷點跨越基因。以細胞中期為基礎的人類染色體核型分析有兩個主要的局限性： 1)對有活力的分裂細胞的依賴； 2)解決的問題有限。在一些臨床環境下，新鮮有活力的標本是不可用于試驗的，這些就阻礙了染色體核型分析。對于大多數的實性腫瘤，染色體的復雜性是不斷改變的，細胞中期染色體的質量較低也阻礙了相關染色體片段的識別。最新研究顯示，在預處理切除標本不可用的情況下，培養粗針活檢標本要優于培養細針活檢標本[6]。多色熒光原位雜交(M-FISH)人類染色體核型分析是通過應用特異性全染色體著色探針組，使每個染色體都被標記了一個特定的顏色。這種核型分析提高了染色體重排的檢測敏感性，例如，聯合二進制比率標簽免疫熒光原位雜交(COBRA-FISH)核型分析[7]。然而，由于價格昂貴，而且需要特殊材料，這些試驗未被廣泛使用。從診斷學的角度，多數已被識別的易位類型的特異性診斷試驗(FISH和RT-PCR，詳見后述)已經得到了發展。這些診斷試驗有著很高的敏感性和特異性，并且可以在現有材料上應用。這些診斷試驗(FISH和RT-PCR)的高選擇性排除了對結果有影響的腫瘤相關的次生改變檢測。

1.2 陣列比較基因組雜交技術 近十年，陣列比較基因組雜交技術已成為檢測基因改變(基因的延長或消失)的強大技術。這種技術已成功用于研究先天的(種屬性的)和后天獲得(腫瘤相關)基因研究。常規應用中的一些參數，例如陣列試驗分辨率(芯片上報告元件的數量)、樣本特性(腐敗或新鮮)、樣本純度(腫瘤細胞比例)等都很重要。已推廣的陣列平臺最初是為掃描基因改變而設計的，因此在外顯子-內含子水平上的個體基因改變的檢測方面所提供的信息是有限的。為了彌補這種局限性，人們開始應用寡核苷酸微陣列比較基因組雜交的方法?？梢杂么朔椒z測和定位目標基因中與外顯子大小相類似的片段改變，在后天或先天基因中都可以應用[8-9]。這項技術使經過脫鈣、甲醛固定、石蠟包埋骨組織的DNA萃取物的分析成為可能[10]。陣列比較基因組雜交技術被寄希望于可直接應用于診斷，對于拷貝數改變的檢測，尤其是當包括多對基因座或變化基因的長度可變時，陣列比較基因組雜交技術會優于FISH技術。已經證實CDKN2A/2B區域純合子缺失使各型腫瘤的預后都較差，而在實例中，常規FISH探針組檢測顯示出相反的結果。假陰性結果或許是由FISH探針覆蓋了部分基因區域的微缺失造成的。由于這些微缺失(5~10 kb)會比實際的探針(90~150 kb)小，因此在這種方法下，微缺失仍檢測不到。其他技術，如arrayCGH或多重連接依賴式擴增技術(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)已可應用于檢測微缺失[11-12]。這些檢測方法已在先天基因(一般的微缺失和重復綜合征基因區域)中體現了優越性。另外，arrayCGH不能用于檢測平衡易位基因。

2 易位檢測

2.1 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)FISH可以在探針覆蓋斷點或與斷點側面相接的情況下識別特異性易位。易位斷點則使區別標記探針組(以紅綠常見)顯現出了不同顏色。如果可以得到甲醛固定、石蠟包埋的組織標本，那么FISH就是最佳選擇。FISH最大的一個優勢在于它可以檢測出非分裂相(細胞間期)細胞胞核內的染色體易位，這種細胞可來源于新鮮、冰凍或甲醛固定石蠟包埋的腫瘤組織標本。同時，FISH也可用于僅有甲醛固定石蠟包埋標本的檢測。然而，FISH在石蠟包埋標本上并不是屢試不爽的，甚至會失敗，尤其是在標本被甲酸或醋酸脫鈣的情況下。FISH對雜質的敏感性較RT-PCR差。用分裂FISH探針組做的診斷試驗不能顯示易位基因的原始位置。這或許與含有EWSR1基因的腫瘤組織有很大的相關性。這個位點的出現是偶然的，并且與臨床表現不典型的骨腫瘤、軟組織腫瘤多樣性有關系。為了找出易位基因的準確易位點，還應當進行附加試驗(協同定位探針組或下文介紹的在RT-PCR基礎上的試驗)。同時，FISH試驗結果還應從組織學和免疫組化的角度進行解釋。

2.2 反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcriptase-PCR，RTPCR) 當運用新鮮冰凍標本時，RT-PCR是首選試驗。RTPCR可用于大多數易位形成的可轉錄嵌合基因的檢測。對于RT-PCR來說，RNA是必要的，且可以從冰凍腫瘤標本中分離出來。從甲醛固定石蠟包埋的骨腫瘤組織標本中分離RNA的過程會受到脫鈣過程的嚴重影響，因此可用冷凍標本。這種技術的優勢在于其只需很少一部分組織材料，使得極少量的活體組織切片和抽取物都可用。還應當注意到融合基因的多樣性，例如，尤文氏肉瘤有18種不同的嵌合基因轉錄物被描述為EWSR1-FLI1，這些都應當在設計引物時加以考慮。檢測產物定序需要在外顯子水平識別易位基因。RT-PCR會遺漏新的或很少出現的轉錄產物。

2.3 突變檢測 基因中核苷酸置換的檢測方法取決于核苷酸置換是否具有復雜性、特異性，還是散在分布于編碼序列的全長。檢測一個變異序列的最直接方法就是熱點突變，熱點突變主要是用來篩選致癌基因中單核苷酸替代物。這些突變通過一種顯性機制激活基因，因此其在變異中的作用是有限的。最近報道的軟骨肉瘤IDH1熱點突變，即為一含有很少核苷酸替代物的基因，但是這些替代物很可能就是導致腫瘤發生的啟動子[13-14]。特異的核苷酸置換可被強大且敏感性極高的方法檢測出來，這些方法可檢測出被非腫瘤組織(如基質或炎性浸潤)嚴重污染的標本中的單個核苷酸置換。這些方法包括： 水解探針實時PCR和焦磷酸測序技術，以及分光儀和斯卡帕基因分型[15-17]。每種方法致力于檢測一個既定核苷酸替代物或小基因缺失、插入基因。

抑癌基因失活的篩查通常需要非常復雜的程序(包括掃描完整基因序列)，這是由于熱點突變不是頻繁發生的。對于某些基因，熱點區域已被確定，比如TP53。這個所謂的“基因組衛士”通常在外顯子5-外顯子8的區域突變。外顯子熱點突變檢測的失敗使得剩余編碼序列的篩查成為必需。預篩選可以用來識別序列變異的存在。當下選用高分辨率溶解曲線分析法[15]。一旦一個序列變異被識別，其精確序列就可被桑格雙脫氧測序法測出。桑格測序法的敏感度不及前面所述的方法，而且必須確保腫瘤組織未受到非腫瘤細胞的嚴重污染。顯微切割使腫瘤細胞富集是必要的，或者可以使用新一代的測序技術，尤其是在很多樣本需要篩檢的時候。

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