PCR及其衍生技術在乙肝病毒基因型檢測中的應用進展＊

王連栓，孫玉杰，張海林（.大理學院公共衛生學院，云南大理 67000；2.云南省地方病防治所，云南大理 67000）

乙型肝炎病毒（HBV）是肝臟疾病的重要致病因子，是嚴重危害人類健康的病毒之一。目前，全世界HBV攜帶者約有3.8億，而我國約有1.5億人。HBV感染后臨床表現呈多樣性，可表現為無癥狀攜帶者、急性肝炎、重癥肝炎或慢性肝炎，其中部分慢性肝炎可演變為肝硬化或肝癌。每年死于乙型肝炎相關性肝病約為50萬人。根據HBV全基因序列異質性大于或等于8%的界線就可以定義為一個基因型標準，可將HBV分為A～H 8種基因型。但最近在日本和東南亞地區發現了不同于以往核酸序列的新基因型：I型和J型[1－2]。有研究證據顯示肝病的轉歸，病情的進展等都與HBV基因型相關。Kato等[3]和Kobayashi等[4]的研究結果表明B基因型常表現溫和的肝纖維化；C基因型易引起浸潤性的嚴重肝臟疾病，并發展成為肝硬化和肝癌；而且C型HBV對干擾素治療反應不敏感。Chu等[5]研究顯示C型感染和肝炎復發也是發生肝硬化的獨立風險預測因子。因此，早期、準確的HBV基因分型對肝病的診斷、治療和病情的預測與轉歸有重要的指導意義。聚合酶鏈反應（PCR）技術是近幾年快速發展起來的分子生物學檢測技術，已廣泛地應用于病原學檢測、基因組研究領域。特別是以PCR技術為基礎的相關技術的不斷涌現，為HBV基因型的檢測提供了有力的依據。為此作者對以PCR技術為基礎的分子生物學檢測方法在HBV基因分型中的應用進展作一綜述。

1 實時熒光定量PCR（FQ－PCR）

FQ－PCR是一種實時定量分析技術，是利用TaqDNA聚合酶的5′－3′外切核酸酶活性，在擴增的同時降解雜交于擴增區域內的探針，使連接于雜交探針的熒光淬滅基團和熒光發射基團分離而產生熒光，因此熒光強度的變化能反映擴增產物量的變化。由于在擴增的每一個循環中均由計算機同步跟蹤和直接探測擴增過程中產物量的變化，不需做擴增后產物的處理或檢測，克服了擴增產物終點檢測所存在的“平臺效應”對產物定量的影響，減少了污染機會，因此本技術具有高度的特異性、靈敏度與準確性。目前，該技術已經廣泛應用于病原體檢測、腫瘤免疫、基因表達、基因組變異等方面。潘克女等[6]，設計2條熒光探針，對240例HBV感染者采用FQ－PCR技術進行基因型檢測。結果基因B型82例，基因C型140例，基因B/C混合型15例，未知3例。同時應用全序列測序法對FQ－PCR檢測出的B型、C型基因標本各10例進行檢測驗證，結果證實與實時熒光PCR法檢測完全一致。由此認為FQ－PCR結果判斷比較簡單、省時、可靠，適合HBV基因型的流行病學調查。蔣新良[7]對36例乙型肝炎患者的血清分別采用熒光定量PCR技術、測序技術、恒溫擴增技術和基因芯片技術進行HBV基因型的檢測，實驗結果表明熒光定量PCR技術特異性100%，敏感性83%，結論認為該技術雖然是目前最常用的技術，但也存在每次檢測只能檢出一種基因型的缺點。為建立一種快速準確的檢測HBV基因型方法，孫余婕等[8]用實時熒光定量PCR方法對150例乙肝患者進行HBV－DNA定量檢測和分型檢測，并對其中的114例標本進行測序分型檢測以驗證所建立方法的準確性，結果HBV分型檢測與HBV－DNA測序檢測的114例樣本中，只要是HBV B基因型、C基因型或B/C混合型，HBV基因分型檢測都能檢出來（共111例），總體符合率為100%。未能被本法檢出的3例樣本經測序分型均為D型。結論認為應用TaqMan探針的實時熒光定量PCR方法能快速對HBV基因型B基因型、C基因型進行檢測，結果準確可靠，特異性高。

2 巢式PCR

此種技術與一般PCR的區別在于用兩對引物代替了1對引物對目標序列進行擴增。第1對PCR引物的擴增與標準PCR十分相似。不過，第2對引物被稱為巢式引物的引物結合到第1輪PCR產物片段上后將引發第2輪的擴增，只是產物比第1輪的短。巢式PCR的優勢在于，如果在第1輪擴增中出現了錯誤的擴增片段，在第2輪擴增中它再次被擴增的可能性非常小。因此該技術是一種特異性很強的PCR技術。Naito等[9]設計特異性引物并進行巢式PCR。首先用共用引物擴增S開放讀碼區，再用加入型特異性引物的混合物進行第2輪擴增，結果擴增出不同長度的核苷酸片段，成功地進行了HBV基因型分型。殷繼明等[10]應用巢式PCR法，設計10條內外引物對276例HBV－DNA陽性標本進行基因分型檢測，結果HBV基因型總檢出率以C型為主，占76.8%，B型占21.7%，B和C混合型占1.5% ，未檢出 A、D、E、F基因型。結論認為該方法簡便易行、敏感性和特異性高，可用于HBV感染的流行病學調查。張于勤和崔魴[11]應用多對型特異性引物巢式PCR方法檢測15例慢性乙肝患者血清中HBV基因型，結果通過兩輪PCR擴增后能直觀地辨別出HBV的基因型，同時還發現有些血清樣品第1輪擴增為陰性，但在第2輪呈陽性，表明此種技術的特異性較高，可減少假陰性和假陽性的發生。試驗中還發現此種方法步驟較復雜，污染機會大，雖特異性高但無法避免出現非特異性擴增條帶的出現。曹家麟等[12]應用型特異性引物巢式PCR對202例HBV－DNA陽性的慢性HBV感染者檢測HBV的基因型，結果成功分型，B型37例，C型123例，B/C混合型41例，D型1例，并取B、C基因型的樣本各2份，D基因型的樣本1份進行測序分析，結果與型特異性引物巢式PCR法一致，表明該方法特異性高。同時也指出雖然該法特異性沒有直接測序法高，但若能嚴格掌握實驗條件也能獲得滿意結果。溫志立和譚德明[13]應用多對型特異性引物巢式PCR方法檢測了220例湖南籍慢性乙型肝炎血清中的HBV基因型，并與目前常用的PCR－RFLP法進行了比較，且同時做重復試驗以證實該方法的可靠性和準確性，結果兩種檢測結果完全一致，重現率100%。因此結論認為這種巢式PCR分型法能清晰直觀地辨別HBV基因型，結果準確、可靠。賴輝等[14]用該方法對80例 HBV－DNA陽性慢性 HBV感染者血清進行HBV基因分型，結果經兩輪PCR擴增后成功分型，B型64例，C型12例，B/C混合基因型4例。試驗中發現該方法操作簡捷，只需進行PCR和電泳，結果清晰直觀不易誤判，對混合基因型的檢測尤為有利。結論認為這種基因分型方法準確可靠，并有很高特異性。王林川等[15]為了建立一種適用于臨床的HBV基因分型的方法，根據HBV基因型（AH）前S1到S基因的保守序列設計12條內外引物，應用該方法對360例乙型肝炎患者血清進行擴增，分型成功348例。有5例樣本第1輪PCR為陰性，第2輪陽性，FQ－PCR測定HBV－DNA＜103copies/mL，經巢式PCR2輪擴增，最終判定為C基因型，提示對于HBV低濃度樣本，巢式PCR優于FQPCR。因此認為此法具有簡單快速、靈敏度高、特異性高的特點，適用于臨床HBV基因分型檢測。

3 限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（PCR－RFLP）

PCR－RFLP基本原理是用PCR擴增HBV的S基因，擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，最后通過不同的電泳圖譜直接分型。此項技術不需對酶切產物進行雜交和測序，方法簡便，分型時間短。國內彭亮和丁靜娟[16]對149份乙肝患者血清用PCR－RFLP分型方法進行基因分型，并與多引物對PCR基因分型方法進行比較，結果發現PCRRFLP方法不僅在分型成功率、敏感度均優于后者，而且操作步驟簡單，減少了污染機會 ，能夠迅速準確地進行A－F各基因型分型，特異性強、靈敏度高，適用于大樣本篩檢及臨床應用。為了驗證PCR－RFLP方法在基因型分型中的準確性，閻麗等[17]用此方法鑒定驗證30例經SPCR－PFLP方法已鑒定出的HBV B、C和D基因型標本，并隨機其中各3株標本進行S基因測序證實。結果兩種HBV基因型分型結果一致。由此認為PCR－RFLP方法能夠準確鑒定HBV基因型，該方法靈敏性高，特異性強，適宜于HBV基因型的流行病學調查。

4 PCR－反向點雜交（PCR－RDB）

該方法將多種核酸檢測探針固定在膜條上，通過與擴增后的待檢靶序列雜交，一次即可進行多種基因亞型的分類，因此有很高的檢測效率，而且簡單經濟?？琢詈偷萚18]采用PCR－反向點雜交法，對203例HBV－DNA陽性患者HBV進行基因型分析。結果成功分型199例，其中B型160例，C型24例，B/C混合型14例，D型1例，結論認為該技術可以簡便地對HBV進行基因型分析，分型成功率高，適用于臨床檢測。楊光等[19]也利用該技術對300份HBV－DNA陽性患者血清進行HBV基因分型檢測，并與基因測序結果比較確定該方法的有效性。結果發現該方法可進行基因分型，并且基因分型結果與測序結果一致。由此認為逆向點雜交技術在進行HBV基因分型中具有，具有靈敏度高、特異性強、簡便和經濟的特點，適用于臨床檢測與流行病學研究。黃燕萍等[20]利用該技術檢測21例慢性乙型肝炎患者，經對陽性患者血清標本PCR擴增，克隆后測序證實分別為不同的HBV基因型及YMDD變異型。結論認為該方法檢測HBV基因型及YMDD變異，經濟實惠、準確快捷，且易于開展。但同時指出本實驗標本量少，需進一步的研究及檢測更多的臨床標本進行驗證。

5 PCR微板核酸雜交－酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

該方法首先用PCR擴增HBV－DNA，擴增產物加入包被HBV通用探針的微孔板后，再加入HBV各基因型顯色探針，同時進行微板核酸夾心雜交－ELISA顯色，從而確定基因型。此方法將基因擴增、核酸分子雜交和酶聯免疫顯色3種診斷技術融為一體，發揮了核酸分子雜交技術特異性高，PCR檢測技術靈敏度高和酶聯顯色檢測方便的優點，分型準確可靠。江秀梅[21]應用此方法對206例HBV－DNA陽性病例進行基因分型，結果B型104例，C型80例，混合型13例，D型9例，分型均獲得成功。王虹等[22]運用該方法對152例乙型肝炎患者的HBV－DNA進行基因分型，結果B型43例、C型57例、D型28例；A型、E型、F型各有5例，同時還檢測到B、C、D三型不同組合的混合型16例。因此認為PCR微板核酸雜交－ELISA方法在進行HBV基因分型中具有準確、快速、簡便的優點，在觀察各基因型致病性及HBV的流行病學研究方面有重要意義。

6 其他相關PCR技術

隨著分子生物學技術的不斷發展，以PCR技術為基礎的相關技術越來越多的應用于HBV基因型的檢測中。例如Chen[23]等設計了能在一個反應管內擴增A～F基因型的多重PCR方法。該法操作簡便，結果易于判定，可檢測出HBV的混合型感染，適用于大規模的流行病學調查，但其靈敏度和特異度還有待進一步提高。黃惠臣[24]根據A型、B型、C型設計引物，對110例HBV－DNA陽性乙肝病毒感染者進行基因分型，結果僅有7例未能分型，顯示此PCR方法能將本地區絕大多數HBV進行定型。因此認為該方法較基因測序，基因芯片和RFLP分型方法操作簡單、快速、可行。

7 結語與展望

HBV基因型與乙型肝炎患者的臨床表現、治療效果、預后與轉歸有著密切的關系，受到國內外學者越來越強烈的關注，其基因分型方法也隨著分子生物學技術的不斷進展而越來越多，但各種分型方法均或多或少地存在某些缺陷與不足，難以廣泛應用于臨床和流行病學調查。比如：基因序列測定法雖是公認的HBV基因分型的金標準，但不管是全序列還是S基因序列測定，均繁瑣費時，費用較高，不適合臨床檢測和流行病學調查；基因型特異性表位單克隆抗體ELISA操作雖然簡便，可對HBV的A～F基因型進行檢測，但其準確性較PCR差，而且所檢測的標本必須是HBV表面抗原陽性血清，對于混合型感染和HBV表面抗原低水平表達的標本可能無法鑒別；DNA芯片分析具有很高的靈敏性和特異性，可對核酸序列進行大規模、高通量的研究，但由于設備要求高，價格昂貴較少應用于臨床。PCR技術是現代分子生物學研究中的一項革命性創舉，操作簡單，靈敏度高，特異性強，是公認的敏感和特異的檢測方法，目前已廣泛應用于基因克隆、檢測、配型、遺傳病的診斷、惡性腫瘤和法醫學等領域。其衍生技術的發展，使PCR技術進一步完善，擴大了其應用范圍，也廣泛的用于HBV基因分型。但如同其他技術一樣，該技術在HBV基因型分型中也存在著一些缺陷，比如型特異引物－PCR分型法雖然是一種比較成熟的基因分型方法，可應用于臨床感染診斷和大規模的流行病學調查，但由于受個別核苷酸變異或病毒載量較低的影響，仍有5%～8%的HBV不能用該方法順利分型；PCR－SSO基因分型法的優點是能檢測所有基因型（A～H），可鑒別某些用直接測序不能區分的混合型感染，但也只能對已建立的基因型進行分型；PCR－RFLP分型方法因為操作簡便，適用于流行病學調查研究，但它也存在遇到混合感染或酶切不完全時，會出現帶型不清而導致結果判斷困難的缺點；PCR微板核酸雜交酶聯免疫分型法雖然綜合運用了3種原理，特異性高，易于自動化，但雜交后需復雜的顯色步驟，而且雜交背景也易受各種因素的干擾。盡管以PCR為基礎的技術在HBV基因型分型中的應用還面臨許多困難，但我們相信，隨著分子生物學的操作技術不斷發展與提高，PCR及衍生技術在HBV基因型分型中一定會操作更加簡便，敏感和特異性更高，而且更適用于臨床及流行病學的調查研究。

[1] Olinger CM，Jutavijittum P，Hubschen J M，et al.Possible new hepatitis B virus genotype，southeast Asia[J].Emerg Infect Dis，2008，14（11）：1777－1780.

[2] Tatematsu K，Tanaka Y，Kurbanov F，et al.A genetic variant of hepatitis B virus divergent from known human and ape genotypes isolated from a Japanese patient and provisionally assigned to new genotype[J].J Virol，2009，83（20）：10538－10547.

[3] Kato H，Orito E，Sugauchi et al.Frequent coinfection with hepatitis B virus strains of distinct genotypes detected by hybridization with type－specific probes immobilized on a solid－phase support[J].J Virol Methods，2003，110（1）：29－35.

[4] Kobayashi M，Arase Ikeda K，et al.Clinical characteristics of patients induced with hepatitis B virus genotype A，B，and C[J].J Oastroenterol，2002，37（1）：35－39.

[5] Chu C M，Liaw Y F.Genotype C hepatitis B virus infection is associated with a higher risk of reactivation of hepatitis B and progression to cirrhosis than genotype B：a longitudinal study of hepatitis B e an tigen－positive patients with normal aminotransferase levels at baseline[J].J Hepatol，2005，43（3）：411－417.

[6] 潘克女，張永樂，劉艷萍，等.實時熒光PCR法分析浙江省乙型肝炎病毒基因型的分布[J].醫學研究雜志，2008，37（1）：51－52.

[7] 蔣新良.四種方法檢測乙型肝炎病毒基因型的比較[J].生物醫學工程學進展，2010，31（2）：86－87.

[8] 孫余婕，沈佐君.實時熒光定量PCR方法檢測乙型肝炎病毒基因型[J].分子診斷與治療雜志，2009，1（3）：148－151.

[9] Naito H，Hayashi S，Abe K.Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type－specific primers[J].J Clin Microbiol，2001，39（1）362－364.

[10] 殷繼明，李卓，劉芳，等.巢式PCR檢測北京地區乙型肝炎病毒因型的分布[J].首都醫科大學學報，2006，27（3）：358－360.

[11] 張于勤，崔魴.多對型特異性引物巢式PCR檢測乙型肝炎病毒基因型分析[J].檢驗醫學與臨床，2010，7（3）：1306－1308.

[12] 曹家麟，吳春明，朱小區，等.應用型特異性引物巢式PCR分析溫州地區乙型肝炎病毒基因型及其臨床意義[J].臨床醫學，2009，29（4）：88－91.

[13] 溫志立，譚德明.多對型特異性引物巢式Pc對盒測湖南省乙肝病毒基因型[J].世界華人消化雜志，2004，12（2）：332－335.

[14] 賴輝，陳濤，候莉，等.川南地區乙型肝炎病毒基因型的分布及臨床意義[J].西南國防醫藥，2009，19（6）：581－584.

[15] 王林川，陳葳，張阿麗.應用nested－PCR對西安市乙肝病毒基因型的研究[J].細胞與分子免疫學雜志.2011，27（7）：803－804.

[16] 彭亮，丁靜娟.PCR－RFLP與多引物對PCR乙肝病毒基因分型方法的比較[J].復旦學報（醫學版），2004，31（5）：534－537.

[17] 閻麗 ，侯金林，郭亞兵.等乙型肝炎病毒基因型S基因PCR－RFLP分型方法的建立[J].中華傳染病雜志，2001，19（4）：224－228.

[18] 孔令和，史國香，張太松.用PCR－反向點雜交法檢測九江地區乙型肝炎病毒基因型[J].分子診斷與治療雜志，2010，3（2）：149－151.

[19] 楊光，崔金環，陳姝.等乙型肝炎病毒逆向點雜交基因分型法建立及應用[J].中華肝臟病雜志，2004，12（11）：677－680.

[20] 黃燕萍，蘭林，李俊剛.等.逆向斑點雜交檢測乙型肝炎病毒基因型及YMDD變異[J].中華檢驗醫學雜志，2006，29（2）：140－142.

[21] 江秀梅.兒童乙型肝炎血清流行病學調查及乙型肝炎病毒基因型分析[D].福建醫科大學碩士學位論文，2008：301.

[22] 王虹，萬成松，王省良，等.采用PCR微板核酸雜交－ELISA技術進行 HBV－DNA基因分型的研究[J].中華微生物學和免疫學雜志，2001，21（2）：234－236.

[23] Chen JS，Yin JH，Tan XJ，et al.Improved multiplex.PCB to identify hepatitis B vires genotypes A－F and subgenotypes BI，B2，CI an d C2[J].J Clin Virol，2007，38（3）：238－243.

[24] 黃惠臣.張家港地區乙型肝炎病毒基因分型及其意義[J].中國熱帶醫學，2006，6（11）：1935－1936.