肺部侵襲性曲霉菌感染的實(shí)驗(yàn)室檢查

許 英，陳友華（.江蘇省泰州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科 5300；.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 009）

曲霉菌廣泛存在于自然環(huán)境中，大部分為條件致病菌。以往認(rèn)為只引起外源性感染，如眼角膜炎、皮膚感染等。但近年來，隨著抗腫瘤藥物、免疫抑制劑和器官移植等治療的廣泛開展，以及在危重患者中廣譜抗生素的長(zhǎng)期使用，侵襲性真菌感染（invasive fungal disease，IFD）的發(fā)病率逐年上升［1］。隨著氟康唑在高危人群中廣泛預(yù)防性使用，白色念珠菌感染有所減少，而非念珠菌及曲霉菌的感染有所增加［2－3］。臨床上由于侵襲性曲霉菌病的增加，如何正確地診斷和準(zhǔn)確檢測(cè)曲霉菌感染的病原體已十分重要。本文根據(jù)本院微生物室的條件，開展了一些曲霉菌感染的實(shí)驗(yàn)室檢查方法，以協(xié)助臨床診斷IPA，為臨床抗感染治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2011年1～12月本院32例胸部CT檢查有陰影、經(jīng)抗生素治療無效的臨床疑似肺曲霉菌病的患者，留取其痰液或肺泡灌洗液標(biāo)本作培養(yǎng)，或者抽取其靜脈血標(biāo)本進(jìn)行血清1，3－β－D葡聚糖檢測(cè)（簡(jiǎn)稱G試驗(yàn)）和半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)（簡(jiǎn)稱GM試驗(yàn)），另外，肺泡灌洗液也可以作G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 沙保羅平皿培養(yǎng) 將痰液或肺泡灌洗液標(biāo)本接種在沙保羅平皿上，放35℃恒溫孵箱24～48h后觀察平皿上菌落生長(zhǎng)的顏色和形態(tài)，初步判斷是否為曲霉菌。

1.2.2 直接涂片鏡檢 取少量沙保羅平皿上疑似曲霉菌的菌落置潔凈玻片，經(jīng)棉藍(lán)染色后鏡檢，如在鏡下見到分隔、呈45°角分支的菌絲，即可判斷為曲霉菌。

1.2.3 血清和肺泡灌洗液檢測(cè)GM試驗(yàn)和G試驗(yàn) GM試驗(yàn)是檢測(cè)曲霉菌生長(zhǎng)過程中向血液中所釋放的細(xì)胞壁成分半乳甘露聚糖（galactoman－nan GM），由于側(cè)鏈上的呋喃半乳糖具有抗原性，因而可以通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法進(jìn)行檢測(cè)。G試驗(yàn)又稱為1，3－β－D葡聚糖試驗(yàn)，可用于系統(tǒng)性真菌病的診斷篩查，但是因?yàn)?，3－β－D葡聚糖是除隱球菌、結(jié)核菌外所有酵母菌及絲狀真菌的細(xì)胞壁的特有成分，也包括曲霉菌，所以其檢測(cè)陽(yáng)性只能提示深部真菌感染的存在，無法用于具體種屬的鑒定。其檢測(cè)原理是通過1，3－β－D葡聚糖肽鏈葡萄糖殘基抗原與馬蹄鱟（東方鱟和美洲鱟）凝血系統(tǒng)中的凝血酶原G因子結(jié)合，經(jīng)凝血酶原級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成凝固蛋白，采用比濁法對(duì)葡聚糖濃度進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.2.4 分子生物診斷技術(shù) 在有條件的情況下，使用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）診斷技術(shù)將在侵襲性曲霉菌感染中起到重要作用。

2 結(jié) 果

32例胸部CT有陰影、抗菌藥物治療無效的患者，痰液或肺泡灌洗液標(biāo)本作真菌培養(yǎng)后，均有絲狀真菌生長(zhǎng)，經(jīng)鑒定均為曲霉菌。同時(shí)對(duì)32例患者作GM試驗(yàn)和G試驗(yàn)，結(jié)果顯示：GM試驗(yàn)檢測(cè)值有27例高于正常值（＞0.5），其中在0.5～0.7之間有5例，0.7～1.0之間有7例，1.0～1.5之間有10例，1.5～2.0之間有5例，說明GM試驗(yàn)特異性高。而G試驗(yàn)檢測(cè)則有29例檢測(cè)值高于正常值，說明G試驗(yàn)敏感度高，提示有深部真菌感染的存在，但不能判斷是否為曲霉菌。由于本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)較少，故不能全面說明兩種試驗(yàn)的特異度和敏感度。

3 討 論

曲霉菌是以枯死植物、動(dòng)物排泄物及動(dòng)物尸體為營(yíng)養(yǎng)源的一種寄生于土壤中的腐生菌，是典型的絲狀菌，占空氣中真菌的12%左右。其形態(tài)特征是在分生孢子的頭部有一個(gè)頂囊，以煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉等為代表。各個(gè)菌種形成的菌落顏色及頂囊形狀均不一樣，可用于菌種的鑒別。由于曲霉菌的孢子主要通過吸入從呼吸道侵入患者體內(nèi)，因此，曲霉菌感染部位主要集中在肺部，從而引起肺部侵襲性曲霉（invasive pulmonary aspergillosis，IPA）。這一點(diǎn)，從分離到曲霉菌的臨床標(biāo)本僅為痰液及肺泡灌洗液就可以證明。診斷曲霉菌在肺部是定植還是侵襲性生長(zhǎng)，關(guān)鍵在于其是否合成GM。如果痰液或肺泡灌洗液標(biāo)本培養(yǎng)到曲霉菌且GM試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即可診斷為曲霉菌侵襲性感染。由于曲霉菌廣泛存在于周圍環(huán)境中，所以送檢標(biāo)本容易受到污染。本室采用多份標(biāo)本送檢和多個(gè)平皿接種。如果多份標(biāo)本、多個(gè)沙保羅培養(yǎng)皿均有曲霉菌生長(zhǎng)，則標(biāo)本受到污染的可能性小。當(dāng)然，與臨床科室的聯(lián)系也是尤為重要的，了解患者是否有肺感染史以及抗生素治療是否有效，患者肺部CT上是否出現(xiàn)大結(jié)節(jié)影伴有周圍出血的征象（即暈輪征），同時(shí)可建議患者進(jìn)行GM試驗(yàn)和G試驗(yàn)檢測(cè)，以協(xié)助臨床醫(yī)師明確診斷。

GM試驗(yàn)常可在患者臨床癥狀出現(xiàn)前5～8d獲得陽(yáng)性結(jié)果［2］，并可對(duì)血清、腦脊液、肺泡或支氣管灌洗液進(jìn)行檢測(cè)，因而往往可以使診斷提前。有文獻(xiàn)報(bào)道GM試驗(yàn)對(duì)于IPA診斷的特異度和敏感度分別達(dá)89%和71%［3－4］。有試驗(yàn)表明肺泡灌洗液中半乳甘露聚糖指數(shù)比血清測(cè)定更準(zhǔn)確，敏感度和特異度均在90%以上［5］，所以GM試驗(yàn)是診斷侵襲性曲霉感染的微生物檢查證據(jù)之一，通過監(jiān)測(cè)GM值也可以作為治療效果的參考指標(biāo)之一。但是GM試驗(yàn)也含有假陽(yáng)性因素［6］：如同時(shí)應(yīng)用哌拉西林／他唑巴坦等抗生素，患者預(yù)處理或放化療后胃黏膜屏障受損食物中的GM成分入血等。

但G試驗(yàn)對(duì)于IPA的早期診斷有局限性，檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性只能提示有深部真菌感染的存在，無法表明是何種真菌感染，判定為IFA。其次某些物質(zhì)中存在1，3－β－D葡聚糖類似物，可造成假陽(yáng)性結(jié)果，如中空纖維濾膜、腎透析儀的洗滌液，紗布等的污染，真菌為原料制成的抗生素，食物中的1，3－β－D葡聚糖通過受損胃腸黏膜入血等情況。另外，G試驗(yàn)檢測(cè)是采用比濁法，故對(duì)血清標(biāo)本要求高，如黃疸、溶血、脂血等情況都會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。

總之，IPA診斷是個(gè)難題，需要結(jié)合臨床癥狀、胸部CT、用藥情況及實(shí)驗(yàn)室檢查等綜合判斷。隨著惡性腫瘤、血液病及免疫功能低下患者數(shù)量的增多，真菌感染乃至曲霉菌感染病例逐漸增多，如何準(zhǔn)確診斷是否為侵襲性曲霉菌病是重要的問題。根據(jù)本室條件，建立以上幾種檢測(cè)侵襲性曲霉菌的方法，比較之下，培養(yǎng)方法及形態(tài)學(xué)檢查是主要的，仍然是經(jīng)典方法。而近年來GM試驗(yàn)和G試驗(yàn)成為曲霉菌感染的實(shí)驗(yàn)室檢查中的非常重要的兩種抗原［7］，而幾種方法聯(lián)合檢測(cè)會(huì)大大提高IPA的確診率［8］，這一點(diǎn)值得實(shí)驗(yàn)室人員密切關(guān)注。

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