梅毒螺旋體抗體化學發光免疫檢測方法的建立及其臨床應用＊

柳麗娟，戴振賢，卓傳尚，謝玉玲，吳玉水△（.福州市傳染病醫院檢驗科 35005；.福建省洪誠生物藥業有限公司，福建莆田 3554）

近年來由梅毒螺旋體（TP）引起的梅毒性傳播疾病的發病率在我國呈上升趨勢[1]。梅毒臨床表現復雜，容易漏診或誤診。因此，梅毒的血清學檢查對鑒別診斷、早期治療和阻斷傳播途徑極為重要[2]。梅毒的血清學檢查作為輸血和術前的必檢項目，包括梅毒血清反應素檢測和梅毒螺旋體特異性抗體檢測。前者敏感性和特異性不理想，后者特異性和敏感性好，成為最重要的診斷指標之一[3－5]。本文應用基因工程重組的梅毒螺旋體外膜脂蛋白TP15、TP17和TP47抗原混合包被微孔板，并以辣根過氧化物酶標記此3種抗原蛋白，結合魯米諾化學發光底物系統，成功建立梅毒螺旋體抗體雙抗原夾心化學發光檢測方法，并初步應用于臨床標本的檢測。

1 材料與方法

1.1 標本來源 福州市傳染病醫院2011年5月11日至11月22日就診患者梅毒抗體陽性血清47份，及2011年11月23日至12月7日門診或住院患者梅毒抗體檢測血清標本305份，共352例，其中男279例，女73例，年齡1～92歲，平均（40.1±15.1）歲，所有血清均－30℃保存待檢。

1.2 主要試劑與儀器 魯米諾及其增強劑對碘苯酚購自Sigma公司；HC－CLA－Ⅲ化學發光分析儀（洪誠公司產品）；洗板機（anthos fluido）；ARCHITEC I1000化學發光免疫分析儀（雅培），白色不透明微孔板購自深圳市金燦華實業有限公司；TP15、TP17和TP47抗原以及辣根過氧化物酶（HRP）標記的TP15、TP17和TP47抗原均購自深圳市菲鵬生物股份有限公司；對照試劑：日本富士梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA），試劑批號：VN10813；雅培ARCHITEC全自動化學發光檢測，試劑批號：09131LP03。TP抗體診斷試劑國家參考品購自中國食品藥品檢定研究院，批號：240013－200901。

1.3 化學發光檢測方法

1.3.1 化學發光底物配制 化學發光底物液分A液和B液，A液用魯米諾及其增強劑對碘苯酚配制，B液為H2O2溶液，使用時A液和B液等量混合后加入。

1.3.2 陰陽性對照品配制 分別取多份梅毒螺旋體抗體陰性或陽性血清，經60℃1h滅活，過濾除菌后適當稀釋配制。

1.3.3 抗原包被板的制備 用0.05mol／L pH9.6的碳酸鹽緩沖液為包被液，將TP15、TP17和TP47混合抗原作不同稀釋度稀釋后，每孔100μL加入微孔板中，置4℃包被24h。PBS洗滌3次后，加0.5%BSA的pH7.4的PBS封閉液，室溫2h后棄去封閉液，除濕干燥后備用。

1.3.4 實驗方法 采用雙抗原夾心一步法檢測TP抗體。主要操作步驟是：包被板設陰性對照、陽性對照、待檢樣品孔。分別加入對照血清和血清標本50μL，然后每孔再加HRP標記的TP混合抗原結合物（每孔50μL，酶結合物1∶3 000稀釋），振蕩混勻后，于37℃溫育60min；然后用PBS洗板5次后拍干；最后每孔加發光底物液（A液和B液等量混合）100 μL，混勻后室溫避光放置5min，用化學發光分析儀測量相對發光值（RLU）。

1.3.5 結果判定 Cut off值＝陰性對照RLU均值×2.1；樣品的RLU值大于或等于Cut off值判定為TP抗體陽性；否則判定為TP抗體陰性。

1.4 準確性實驗 將生產的三批梅毒螺旋體抗體化學發光免疫檢測試劑（批號：111110；111120；111130），檢測20份TP抗體國家陰性參考品，10份國家陽性參考品、精密度參考品以及L1、L2、L3和L4共4份靈敏度參考品。

1.5 穩定性實驗 將TP抗體化學發光診斷試劑置37℃3d后，檢測20份TP抗體診斷試劑國家陰性參考品、10份國家陽性參考品、精密度參考品以及L1、L2、L3和L4共4份靈敏度參考品。

1.6 與對照試劑進行比較 嚴格按照試劑盒中操作步驟進行檢測，并在試劑盒有效期內使用。

2 結 果

2.1 準確性 將生產的三批梅毒螺旋體抗體化學發光免疫檢測試劑（批號：111110；111120；111130）檢測TP抗體診斷試劑國家參考品，檢測結果符合均國家質量標準，結果見表1。

2.2 穩定性 將TP抗體化學發光診斷試劑置37℃3d后，檢測20份TP抗體診斷試劑國家陰性參考品結果為全部陰性；檢測10份國家陽性參考品結果全部為陽性；精密度參考品檢測的批內變異系數為8.19%，符合國家質量標準要求；L1、L2、L3和L4靈敏度參考品檢測結果為全部符合國家質量標準要求。

2.3 與其他進口試劑比較

2.3.1 以TPPA結果為參照標準，特異性（陰性符合率）＝（292／295）×100%＝99.0%；靈敏度（陽性符合率）＝（56／57）×100%＝98.2%；總符合率＝（348／352）×100%＝98.9%。見表2。與參照試劑比對，Kappa值＝0.96，一致性強度最強（0.81～1.0）。

表1 三批產品檢測TP抗體診斷試劑國家參考品實驗結果

表2 本化學發光試劑與TPPA試劑測定結果對比（n）

表3 本化學發光試劑與TPPA試劑測定結果對比（n）

表4 352例標本中三種試劑檢測不一致結果

2.3.2 與雅培ARCHITEC全自動化學發光檢測結果比較，陰性符合率＝（291／295）×100%＝98.64%；陽性符合率＝（556／58）×100%＝96.55%；總符合率＝（56＋291）／352×100%＝98.58%；Kappa值＝0.95，一致性強度最強，見表3。兩者檢測結果不一致的樣本S／CO＜5.0，TPPA檢測結果均陰性，見表4。

3 討 論

目前臨床常用的TP抗體的檢測方法有梅毒螺旋體血球凝集試驗、TPPA、熒光梅毒螺旋體抗體吸附試驗、酶聯免疫吸附試驗、化學發光法等。前三者檢測試劑成本高，操作較煩瑣，耗時較長，不適合大量標本的篩查。酶免法試劑是目前檢驗科常用的免疫學檢測方法，適合梅毒的大規模篩查，但靈敏度和特異性不及前三者，且存在一定的假陽性。而化學發光免疫檢測方法由于靈敏度高、特異性強、操作簡便、快速、線性范圍較寬等優點，被認為是最有發展前景的實驗室診斷方法之一[5－6]。由于進口產品價格昂貴，因此成功研制和生產抗梅毒螺旋體測定試劑盒化學發光免疫檢測試劑盒具有重大的經濟和社會效益。

本研究應用基因工程重組的梅毒螺旋體外膜脂蛋白TP15、TP17和TP47抗原混合包被微孔板，并以辣根過氧化物酶標記此3種抗原蛋白，結合魯米諾化學發光底物系統，建立了梅毒螺旋體抗體雙抗原夾心化學發光檢測方法。應用TP抗體診斷試劑國家參考品分析所建立方法的特異性、靈敏度、穩定性和精密性，并與進口TPPA、雅培發光，比較檢測臨床血清樣本352份。結果表明所建立的方法用于檢測梅毒螺旋體抗體國家參考品，符合國家參考品質量標準。批內變異系數4.68%～5.77%、批間變異系數12.82%；試劑盒置37℃考核3d，其穩定性良好。與TPPA法、雅培化學發光法對照，陽性符合率分別為98.2%、96.55%；陰性符合率分別為99%、98.64%；總符合率分別為98.9%、98.58%；Kappa值分別為0.96、0.95，一致性強度均最強（0.81～1.0），本研究試劑與進口檢測試劑之間具有等效性。本文建立的方法具有操作簡便、檢測時間短，容易自動化，適合批量檢測，便于及時地報告檢測結果。因此，本研究成功建立了特異、敏感和穩定的梅毒螺旋體抗體化學發光免疫檢測方法，適用于梅毒感染的快速批量篩查，具有較大的臨床應用價值。

[1]中國疾病預防控制中心性病控制中心.2006年全國梅毒與淋病疫情分析報告[R].北京：中國疾病預防控制中心性病控制中心，2006.

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