HIV抗體實驗室檢測的質量控制與管理

羅曉璐 黎建源 蘇國生 韋善求 梁娟英

質量控制(quality control)，簡稱質控，是為了監測和評估本實驗室的工作質量，以此來決定本實驗各種檢驗結果能否發出的檢查和控制手段。為達到規范或規定對數據質量要求而采取的作業技術和措施［1］。作為廣西艾滋病臨床治療中心(南寧)的HIV初篩實驗室，HIV抗體檢測的質量控制與管理顯得任務格外沉重，為了探討HIV抗體實驗室檢測的質量控制與管理情況。筆者總結了近年來在HIV初篩實驗室管理工作中所遇到的相關質量控制與管理問題，現將結果總結如下。

1 HIV抗體檢測的方法和程序

1.1 篩查試劑 必須由國家食品藥品監督管理局注冊批準，批批檢驗合格、試劑均在有效期內。使用經過臨床質量評估為敏感性和特異性都高的試劑。

1.2 篩查方法 酶聯免疫試驗(ELISA)，采用第三代ELISA(雙抗原夾心法)。按照檢驗目的選取符合標準要求的篩查試劑對臨床樣品進行初篩檢測和復檢。

1.3 實驗準備 試驗開始前將試劑和樣品放置在室溫(18～23℃)，做好試劑準備。磷酸鹽緩沖液:若溶液中有結晶析出，應將其置于37℃水浴箱中溫浴溶解，再用蒸餾水以1:25的稀釋倍數稀釋濃縮液，至4℃冰箱保存2周。TMB底物液在使用之前配制，TMB溶液和過氧化脲溶液按等量均勻混合。1 m硫酸終止液是將85 ml的蒸餾水中加入5 ml濃硫酸溶液中。待試劑盒、外部質控血清及待檢標本準備好后，嚴格按照試劑盒說明書操作并做好各項質控和安全防護要求進行篩查檢測。

1.4 實驗操作步驟 ①裝好所需使用數目的孔條，每孔均加入100 μl樣品稀釋液。設陰性對照孔3個和HIV-1陽性對照孔1個，還可增設HIV-2陽性對照孔1個。②每孔各加加入待檢樣品及對照50 μl，未使用到的孔加滿樣品稀釋液以溶解結合物球，避免堵塞洗板機針孔。震搖15 s左右，于(37±2)℃水浴箱孵育(60±5)min。③置全自動洗板機上洗滌6次(手工法將配好的洗滌液將反應孔完全加滿，靜置30～60 s，甩掉孔內洗液，在注滿，反復共洗滌6次，洗完后孔上方及底部不應殘存液體，禁止在濾紙上拍干)。④每孔加入100 μl底物液，勿攪動，室溫避光孵育(30±2)min。⑤各孔加入1 m硫酸100 μl終止反應，震搖混勻。⑥置酶標儀上讀數，單波長為450nm，雙波長為450/630nm處讀取OD值。

1.5 實驗結果 ①陰性對照(NC)，HIV-1陽性對照(PC1)，HIV-2陽性對照(PC2)，NC必須 ＜0.25方可用，排除NC≥0.25的值，計算NC平均值。陰性對照范圍為0.6倍陰性對照均值＜NC＜1.4倍陰性對照均值。②符合PC1-NC均值≥0.4，PC2-NC均值 ≥0.4條件的NC可可以使用。③Cut off值 =陰性對照均值 +0.100，小于Cut off為陰性，大于或等于Cut off為陽性。

1.6 報告 對呈陰性反應的樣品，可由實施檢測的實驗室出具HIV抗體陰性報告;對呈陽性反應的樣品，須進行復檢，不能出陽性報告。

1.7 復檢試驗 對初篩呈陽性反應的樣品用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的篩查試劑重復檢測。當兩種符合初篩標準要求的試劑復檢均為陰性，則可報報告HIV抗體陰性;如均呈陽性反應，或一陰一陽，則送AIDS確認實驗室進行確認。

2 HIV抗體實驗室檢測的質量控制與管理

HIV抗體實驗室檢測的質量控制與管理必須符合《全國艾滋病檢測工作規范》的要求［1］，保證檢測質量。做好艾滋病實驗室的質量管理，就要做到HIV抗體檢測的質量保證、質量控制和質量評價。

2.1 HIV抗體篩查的質量控制與工作程序

2.1.1 質控血清的制備和保存 在每次實驗中必須包含有內部對照質控血清和外部對照質控血清。內部對照是質量控制的基礎，內部對照質控血清來自試劑盒內的陽陰性對照。每一次實驗室檢測要使用同一批號試劑盒中中的內部對照質控血清。外部對照質控血清主要是為了監控實驗室檢測的重復性和穩定性，同時觀察試劑盒批間或孔間的差異，外部對照質控血清包括陰性、弱陽性和強陽性對照血清。也可以只設置一個弱陽性對照，濃度為該試劑盒臨界值(Cut-off)的2～3倍。

2.1.2 外部對照質控血清的制備 HIV抗體陽性和陰性血清，56℃ 30 min滅活，3000 r/min，離心15 min。弱陽性對照可取HIV抗體強陽性血清用HIV抗體陰性血清梯度進行稀釋并標定后取得。按一年的用量進行配制(也可加入一些不影響檢測結果的防腐劑)并取0.2 μm得濾膜過濾除菌。

2.1.3 外部對照質控血清的保存 按一周實驗用量分裝、分類、標記、封口、-20℃凍存于非自動除霜冰箱中。外部對照血清禁止反復凍融，一旦融化后應該存放在2～8℃冰箱內，僅供使用一周。

2.1.4 外部對照質控血清的使用 每一次實驗必須使用外部對照質控血清，以便監控實驗的重復性和穩定性。同時可以了解批間或孔間試劑盒的差異，以繪制質控圖。

2.1.5 外部對照質控物的質量要求 質控物的管間或瓶間變異必須小于監測系統預期的變異范圍(cv＜20%)，并且質控物的成分應在穩定狀態下。質控物應無影響ELISA反應的細菌和防腐劑。

2.2 質控圖的建立及應用(以ELISA試驗檢測HIV抗體為例)最常用的質控圖是Levey-Jennings質控圖，使用累計和技術或趨勢分析技術的圖形可提供系統偏移和漂移的狀況。

2.2.1 建立質控圖參數 外部對照質控物的平均值和標準差應建立在實驗室常規使用方法對質控物重復測定的基礎上。一般采用不同批次檢測20個數據，僅做少量批次也至少做5個批次的檢測，每個批次中不少于4個質控物測定結果，以建立一個臨時性的平均值和標準差，當達到20批次數據后，替代臨時性的平均值和標準差。算術平均值):是一組質控血清S/CO值的平均值。統計學上采用至少20次(天)所測得的外部對照質控S/CO值來結果計算出平均值。標準差(s):指樣品檢測值與均數之間的離散程度，是與對照血清S/CO均值有關的預期范圍。通常一組S/CO值的標準差以s表示。變異系數(cv):是反映各次S/CO值相對于均值離散程度的一個指標，可以用來衡量檢測的重復性或精密度。控制限:主要是由實驗室根據質控物檢測結果的平均值和標準差來劃定。例如12s質控規則的控制限為外部對照S/CO平均值加減2個標準差;13s質控規則的控制限為外部對照S/CO平均值加減3個標準差。

2.2.2 繪制質控圖 質控圖是把檢測數據與已確定的(計算出的)“控制限”進行比較的圖，包含一條中心橫線和其上、下兩條平行的控制線，并按時間順序點入本實驗室每次試驗質控血清的測定值。在常規條件下，對同一批質控品連續檢測20次(天)或以上，收集一組S/CO值，求均數)和標準差(s)，超出2 s或3 s的數據不應刪除。將質控均值)和標準差(s)分別標注在質控框架圖中。以S/CO值作縱座標(Y軸)，每一次(天)試驗作橫座標(x軸)，繪制質控圖。自第21次起，將各次質控結果依次點入質控框架圖中，以使檢驗進入質控過程。

2.3 質控規則及使用 實驗室在報告實驗結果之前必須評價質控數據，可通過圖形記錄的檢查或由計算機審核結果來決定。目前常用12s和13s質控規則。告警(12s):指外部對照的S/CO值超出+2 s范圍，應分析是否可以繼續檢測或進一步觀察。由于12s做為失控標準，會有較高的假失控概率，因此一般不采用。失控(13s):指外部對照的S/CO值超出+3 s范圍，判斷為失控。提示實驗結果不能被接受，可能跟系統誤差、隨機誤差或外部對照滴度下降有關。位移:主要指連續幾次(3～5次)外部對照S/CO值都落在質控均值的同一側則，提示實驗條件發生一定的變化。趨勢:指連續有幾次(5～7次)外部對照質控S/CO值幾乎往一個方向分布，通常認為是由參數的緩慢改變所引起。使用質控規則來檢驗隨機誤差和系統誤差，使之成為檢出較高的分析誤差的能力，同時應具有較低的假失控概率。采用多標準質控方案來考察試驗系統的可靠性，而多規則的質控方法能提高誤差的檢出率，并具有低的假失控概率。其要點為:質控結果有一次落在2 s范圍意外，判斷為告警狀態，值得注意，并觀察是否可以繼續檢測。出現下列情況時，應暫停檢測查找原因:出現一次3 s范圍的變化、連續兩次出現同一方向2 s范圍的變化、連續四次出現同一方向的1 s范圍的變化、連續10次結果都在1 s范圍內，但落在均值線的同一側。

2.4 質控圖的分析及失控處理 實驗室需建立相應的質控圖析及失控處理程序。當質控已執行時，使用平均值和標準差來計算該項目的質控限，將假失控概率降到最低。當出現失控時進行如重復質控測定或重新分析新的質控物不是最有效的方法，必須找出問題原因，找出解除故障的方法，并消除原因，防止將來出現同樣的問題。

繪制和分析質控圖的要點:①要在常規條件下建立質控圖參數，用S/CO比值繪制質控圖。對同一批質控物連續測定得到20個數據，求均值)和標準差(s)，超出2 s或3 s的數據不應刪除。②由專人負責建立質控圖，每月定期召開質控分析會，討論本月的質量控制情況。③建議長期和穩定地使用一種質量好的試劑盒，更換不同廠家的試劑盒后，必須重新繪制質控圖。④改用新批號試劑盒也應重新制作質控圖。使用不同批號、不同廠家的試劑盒需在質控圖上標注使用日期。發現失控，應及時填寫報告單，上交負責人，分析失控原因并討論是否發出檢測報告結果。⑤使用新批次的外部對照質控物時，必須重新繪制質控圖。⑥變異系數(cv)小于20%，表示外部對照處于穩定狀態。

3 討論

為了保證HIV抗體實驗室檢測結果的可靠性，HIV抗體初篩實驗室需要建立一套規范的質量管理體系，并擁有縝密的實驗室質量保證、質量控制和質量評價的計劃和措施［1-5］。設立儀器的維護保養及校準制度，以保證儀器的正常運轉。滿足HIV實驗室檢測需要并盡可能對檢驗結果造成誤差的儀器設備進行校準。主要有:酶標儀、洗板機、水浴箱、冰箱、溫濕度計、移液器等。各儀器設備的校準方法按其相應的校準SOP進行。儀器設備校準后應有校準記錄，并保存于儀器管理檔案中。儀器設備每半年進行一次校準。儀器設備維修后需進行校準，合格方可重新投入使用。每天核對酶標讀數儀、洗板機濾光片的波長，檢查洗板機管道是否通暢及是否有漏液現象。每周需清潔儀器表面并保證光學零件不沾灰塵。每月檢查洗滌時各孔與對應的沖洗頭是否對位良好，負壓是否符合工作要求。每年檢查清洗濾光片，出現破裂或霉點應及時更換。根據儀器內具有的校準程序或使用校準板，對濾光片的精密度進行校準并保留記錄。實驗過程中發現儀器出現異常情況，應及時給予處理，必要時更換零部件。移液器1年至少應該標定1次，發現異常情況應隨時進行校準。標定方法包括有色溶液光譜分析法、稱量校準法、同位素計數法以及使用配套校準盒等。多道移液器校準須保證每一個加樣頭都能連續、準確地加樣，移液器的精密度需在廠家出廠時規定的范圍內。另外加強人員培訓工作，工作人員必須持證上崗，建立一支具有高素質、醫德好、技術精湛的實驗室檢測團隊，還要不斷增加新技術人員［2-6］。只有這樣，做好HIV抗體初篩實驗室的質量保證、質量控制和質量評估，HIV初篩實驗室管理才有可能落到實處。

［1］中國疾病預防控制中心.全國艾滋病檢測技術規范(2009年修訂版)，2009:50.

［2］王興金，張金元，吳學美，等.艾滋病抗體檢測實驗室質量控制探討.中國中醫藥咨訊，2010，2(36):352.

［3］高丹，吳旭.艾滋病篩查實驗室保證檢測質量應注意的問題.中國衛生檢驗雜志，2008，18(2):364，374.

［4］朱豐秀，吳中發.贛州市艾滋病網絡實驗室質量控制狀況評估.實驗與檢驗醫學，2011，29(2):157-159.

［5］喬恩發，陳會超，楊莉，等.人類免疫缺陷病毒快速檢測實驗室質量控制.檢驗醫學與臨床，2011，8(21):2685-2686.

［6］榮幸，張永旭，張海波.HIV篩查實驗室的質量管理.當代醫學，2011，17(1):37-38.