兩種EDTA脫鈣方法的比較

李喜紅 楊海新 張睿

骨由骨組織、骨膜及骨髓等構成。骨組織是一種堅硬的有一定韌性的結締組織，它由大量鈣化的細胞間質及數種細胞組成，鈣化的細胞間質即稱為骨基質。骨基質由有機成分和無機成分構成，含水極少，骨基質中的有機成分由成骨細胞分泌形成，包括大量的膠原纖維(占有機成分的95%)及少量無定形基質，無機成分又稱為骨鹽，主要為羥磷灰石結晶(Ca10(PO4)6(OH)2)，骨基質的有機成分和無機成分緊密結合使骨十分堅硬，不能之間制成切片。

對骨組織脫鈣［1］是科學研究及病理檢測的常用技術，也是一大技術難點，要制作一張可用于免疫組化的骨組織切片并非容易。傳統的脫鈣方法主要有酸類脫鈣液、螯合劑(EDTA，乙二胺四乙酸二鈉)脫鈣液等。酸類脫鈣液雖脫鈣時間較短，但是常會破壞細胞形態及骨組織的正常結構，影響病理觀察及免疫組化結果。目前在實驗室及臨床中常用不同濃度的EDTA脫鈣液對骨組織進行脫鈣，這一方法不破壞骨組織的細胞結構，方便對其進行分子水平的研究。

1 材料

在實驗室中獲得兔下頜骨標本后，將下頜骨截斷制成長約2 cm的骨段。

2 脫鈣液的配制

本實驗中選用15%EDTA溶液作為研究對象，將150 gEDTA、800 ml蒸餾水及50 gNaOH充分攪拌溶解后，使用濃鹽酸調節PH值至7.0～7.5。

3 脫鈣方法

3.1 脫鈣前準備 去除骨段表面的軟組織及骨膜，生理鹽水沖洗標本后，放入中性福爾馬林溶液中固定24 h，取標本于流動清水下沖洗20 min以清除骨組織表面的中性福爾馬林。將骨段平鋪于微波爐專用盒，倒入適量脫鈣液，使脫鈣液高度至少為骨段高度的20倍。因脫鈣溫度不宜過高，故脫鈣前進行預實驗，將蒸餾水置于微波爐中中火輻射2 min，水溫可保持在45℃ ～65℃之間。脫鈣終點標志為大頭針無阻力穿透骨組織。

3.2 15%EDTA微波脫鈣法 將盛有脫鈣液及骨段的微波爐專用盒置于微波爐中，中火間歇脫鈣，輻射時間為5 min/次，輻射間歇期間將標本盒置于室溫下冷卻10 min，每天循環50次，每天更換脫鈣液，4 d后脫鈣完成。

3.3 15%EDTA低溫脫鈣法 將標本盒置于4℃環境內，每5 d更換脫鈣液，直至脫鈣成功共歷時47 d。

4 制片

脫鈣成功后將標本常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、裱片、烤片、脫蠟、染色、中性樹膠封存。

5 結果

5.1 脫鈣時間 使用微波脫鈣法脫鈣時間較短，適合臨床病理檢查使使用。低溫脫鈣法脫鈣時間較長，更適合實驗室使用。

5.2 HE染色 制作HE染色切片過程中，微波脫鈣法脫鈣的標本有部分切片出現脫片且切片時能明顯感覺到阻力略大，低溫脫鈣法切片容易，為出現脫片情況。兩種脫鈣方法處理的標本制成的切片在鏡下觀察見骨組織結構完整，細胞結構清晰，細胞質呈現淺枚紅色，細胞核呈現藍紫色，兩者對比度強。微波脫鈣法脫鈣后制成的切片在高倍鏡下仍可見鈣化點的存在，低溫脫鈣法脫鈣后制成的切片鏡下未見鈣化點，視野清晰、干凈。

6 討論

最早的脫鈣方法是使用鹽酸、硝酸、硫酸等強酸溶液或醋酸、甲酸等有機酸進行脫鈣，使用強酸脫鈣，雖然脫鈣時間較短，脫鈣效果也較好，但強酸對組織結構破壞性較大致使染色效果不理想，而使用有機酸脫鈣作用較溫和，但脫鈣時間較長會致使組織膨脹同樣導致組織結構改變，因此，不斷有學者改善脫鈣液配方，對于脫鈣前的固定過程，有學者在固定前通過血管灌注法使固定液滲入組織及細胞中，這種方法使固定更加充分和均勻，這一方法保證了切片質量及染色質量。近年來EDTA脫鈣液的使用越來越廣泛，逐漸成為可科學研究中首選的脫鈣劑，使用EDTA脫鈣不損傷組織及細胞的形態結構及抗原等物質的性質，脫鈣效果較好，但脫鈣時間較長，不適宜需短時間內完成脫鈣的標本［2］，EDTA脫鈣液的濃度一般選擇10%左右，濃度過高或過低都會使脫鈣不充分或破壞組織結構。為解決EDTA脫鈣時間較長這一缺點，有學者研究使用EDTA-微波輻射聯合脫鈣的方法，獲得了較好的效果，脫鈣時間明顯縮短，HE染色效果較好［3］，但使用這種方法脫鈣時加熱時間不好把握，且程序較為繁瑣不易掌握，容易過度脫鈣對標本造成破壞。國外有學者經過使用恒溫4℃環境下EDTA脫鈣的方法對骨組織進行脫鈣取得較好效果。

本實驗中選擇的兩種脫鈣方法具有代表性，脫鈣液的濃度合適，未對細胞結構造成破壞，EDTA微波脫鈣法可滿足臨床病理的需求，而EDTA低溫脫鈣法則更大程度的保存了細胞結構，且對標本完全脫鈣，保證了免疫組化檢測時定性定量的準確性。

［1］龔志錦，詹榕洲.病理組織制片與染色技術.上海:上海科學技術出版社，1994:280.

［2］王穎，洪麗華，吳哲，等.口腔硬組織切片的固定脫鈣染色方法統計分析.吉林醫學，2007，28(11):1315-1316.

［3］姚麗艷，趙偉，呂紅兵.3中脫鈣液對牙體牙周聯合切片H-E染色效果的對比.福建醫科大學學報，2006，40(3):298-299.