骨髓間充質干細胞的研究進展

閆德祺 閆英選 孫朝陽 宋繼祖 羅金寶

1.甘肅中醫學院基礎課部，甘肅蘭州 730000；2.黃淮學院，河南駐馬店 463000；3.海南醫學院，海南海口 571199；4.河南省駐馬店市第一人民醫院，河南駐馬店 463000；5.甘肅省永靖縣水電四局醫院，甘肅永靖 731600；6.甘肅省皋蘭縣忠和鎮衛生院，甘肅皋蘭 730203

骨髓間充質干細胞的研究進展

閆德祺1，2閆英選3孫朝陽4宋繼祖5羅金寶6

1.甘肅中醫學院基礎課部，甘肅蘭州 730000；2.黃淮學院，河南駐馬店 463000；3.海南醫學院，海南海口 571199；4.河南省駐馬店市第一人民醫院，河南駐馬店 463000；5.甘肅省永靖縣水電四局醫院，甘肅永靖 731600；6.甘肅省皋蘭縣忠和鎮衛生院，甘肅皋蘭 730203

骨髓間充質干細胞（BMSCs）是骨髓基質中存在的非造血系的成體干細胞，具有多向分化潛能，已成為國內外基礎醫學和臨床醫學研究的熱點。本文簡要介紹了BMSCs的概念提出、生物學特性、培養、鑒定，并根據近年來國內外包括應用中藥進行的誘導分化、組織工程、基因治療、再生醫學等相關研究及臨床應用前景作一綜述。

骨髓間充質干細胞；誘導分化；組織工程；中藥

早在1867年，世界著名病理學家Cohneim發現了骨髓中非造血系的干細胞，發現這類干細胞能夠產生愈合傷口的成纖維細胞，后來Caplan[1]稱之為間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），因為這類細胞除骨髓外，還廣泛分布于脂肪、外周血、臍血、羊水、胎盤、胎肺、胎腎、牙髓、肌腱、滑膜、骨骼肌等不同的組織中，可定向分化為造血細胞以外的神經膠質細胞、肌細胞、腱細胞、成軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、平滑肌細胞等多種細胞，支持造血，對造血干細胞有擴增作用，具有貼壁生長、高度可塑、免疫調節的性質，在體外易分離和擴增，還易于外源基因的轉入和表達[1-2]。本文在此基礎上對骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的研究及其應用作一綜述，以期開拓新的研究領域和臨床應用。

1 改良性的BMSCs分離培養和鑒定方面的研究

體外培養的小鼠及人的BMSCs形態學特征主要表現為梭形、紡錘形，少數為多角形。BMSCs的體外分離方法有四類：貼壁培養法、密度梯度離心法、流式細胞術和免疫磁珠分離法。貼壁培養法更換培養液去除造血系細胞后還殘留有單核細胞、淋巴細胞貼壁生長，需要嚴格控制胰蛋白酶的劑量和消化時間，連續培養才能清除并得到相對的純化[3]。其余方法雖然可以獲得純度較高的BMSCs，但易破壞其活性。因此培養鑒定方法的改良引起了研究者的興趣，以期探索獲得高純度BMSCs的簡單、系統的實驗方法。

目前尚未發現公認的BMSCs特異性表面抗原。BMSCs表達 CD34、CD106、CD124、CD105、CD146、CD90、CD13、CD44、CD54、CD29、CD73、CD120a、CD166 等，不表達造血細胞的標志 CD10、CD11b、CD14、CD31、CD34、CD45、CD49、CD106[4-6]，其中有關CD34、CD106的報道不一致。通常還是通過形態和培養特性結合免疫方法進行BMSCs鑒定。

2 BMSCs免疫研究

BMSCs抑制T細胞增殖導致免疫耐受[7]。把BMSCs與T細胞共同培養，T細胞不增殖，且可以對其他異物進行反應，隨著干細胞的分化，其抗原性并未隨之增加，說明BMSCs移植潛力很大。Miyake等[3]認為BMSCs能夠體外抑制T細胞功能，指出BMSCs可以作為免疫調節劑，控制移植物抗宿主病的發生，以BMSCs注射受體小鼠骨髓腔，再注射供體細胞，能夠預防移植物抗宿主病。

3 誘導分化與相應的組織修復研究

干細胞在不同的情況下表現出不同的分化方向。BMSCs經誘導后可定向分化為樹突狀細胞、多巴胺能神經元、關節盤細胞、心肌細胞、成軟骨細胞、肌腱細胞、脂肪細胞、成骨細胞、星形膠質細胞、血管內皮細胞[7-10]，因而可望進行相應的組織修復，比如免疫功能的修復、分泌多巴胺的神經細胞的數量增加、關節盤的修復、損傷的心肌的修復、骨骼肌的修復、軟骨和骨骼的修復、血管的修復等。BMSCs的體外分化是組織工程的良好方法。

4 BMSCs標記的改良研究

采用BrdU標記BMSCs，聯合BrdU單克隆抗體進行免疫組化染色，48 h后細胞標記率＞90%，且不影響細胞的形態、生長、增殖及分化。Zhang等[11]認為BrdU標記是對移植的BMSCs遷移、增值、分化等行為進行動態觀察的切實可行的方法，而且具有無放射性污染、節約時間、操作方便迅速、標記效率高、準確性高等優點。

5 不同方向的動物實驗及臨床應用研究

BMSCs可被定向誘導分化為臨床所需的多種組織細胞，因其取材方便、易于體外培養、擴增迅速、較弱的免疫原性，能較好地抑制混合淋巴細胞反應，不存在組織配型和免疫排斥等方面的問題，符合倫理道德原則，被稱為組織工程及再生醫學中理想的種子細胞[2,4]，可用于不同方向或目的的動物實驗及臨床應用研究。Zuo等[12]將關節軟骨細胞與BMSCs共同培養，發現它們之間存在著相互作用，BMSCs對加強關節軟骨基質的形成起著刺激和支持作用，直接接觸的效果比可溶性因子的作用更大。Boonyagul等[13]應用不同濃度的乙酰化甘露聚糖處理大鼠BMSCs的體外實驗結果顯示，乙酰化甘露聚糖顯著增加BMSCs的增殖，血管內皮生長因子、骨形態發生蛋白-2、骨涎蛋白和骨橋蛋白的表達，堿性磷酸酶的活性與骨質沉積。在體實驗結果顯示，乙酰化甘露聚糖治療組與未處理的對照組相比有較高的骨密度，骨愈合快，治療組骨小梁大量生長，表明乙酰化甘露聚糖可通過刺激BMSCs進行增殖，誘導骨形成的生物活性分子，使BMSCs分化為成骨細胞，合成細胞外基質。Xin等[14]將BMSCs與無細胞生物材料支架結合成功地重建了組織工程心臟瓣膜，表明種子細胞與生物支架整合的可行性，且促進血液中BMSCs的增值和分化。Matsumoto等[15]應用電刺激誘導BMSCs分化成神經細胞，然后移植給腦損傷模型小鼠，發現電刺激的BMSCs細胞順利分化成神經細胞，而不是分化成星形膠質細胞，促進了腦損傷的恢復，且發現電刺激的BMSCs細胞表達神經元素2增加，通過β-catenin通路抑制BMSCs向星形膠質細胞的分化，促進其向神經細胞的分化，表明BMSCs治療腦損傷的前景廣闊。

6 中醫藥結合BMSCs的研究

中藥可以通過調節微環境的生長因子水平，促進微循環血供，形成一個有利于移植細胞存活的微環境，促進干細胞的定向分化，進而應用于臨床治療。高志超等[16]應用補骨脂素誘導BMSCs，結果表明，BMSCs復合載異補骨脂素支架材料具有顯著的骨誘導作用，可應用于臨床修復骨缺損。范東艷等[17]將紅景天苷與BMSCs聯合應用治療帕金森病大鼠，發現治療后大鼠行為異常程度較輕，腦組織內酪氨酸羥化酶mRNA表達水平較高，表明聯合用藥優于單獨應用中藥或BMSCs。程小麗等[18]應用補腎益髓中藥血清孵育BMSCs進行移植，顯著提高了缺血腦組織中生長因子和神經營養因子的水平，較快地恢復了大腦功能；該研究團隊還應用地黃飲子孵育BMSCs進行移植，能夠顯著提高大鼠缺血損傷腦組織的Bcl-2水平，降低Bax的水平，對缺血性腦損傷具有保護作用。

7 結語

BMSCs方面的研究進展很快，前進中也遇到了如下一些問題：①到目前為止，人們對BMSCs的認識仍停留在培養細胞的特征上，BMSCs的定義仍然是根據體外培養的細胞自我更新和分化的潛能而提出的“權宜性”的概念；人們對活體內干細胞的形態特征、發育起源、解剖定位以及在器官生成和出生后組織穩態中所起的作用還知之甚少；目前尚缺乏作為干細胞所應具有的非對稱分裂特征的證據，未發現BMSCs特異性的表面標志物，難以直接鑒定，還是根據形態等非特異性表面標志物來判斷，BMSCs的 “干細胞性”還需要大量的實驗來進一步證明。②由于干細胞的特性、分離方法的限制及BMSCs培養過程中的異質性，幾乎不可能得到絕對純化的BMSCs，分離方法的改良研究很多，仍需進一步深化。③由于實驗方法、實驗條件的不同，來自不同實驗室的報道不盡一致，甚至有不少矛盾的地方，BMSCs在不同條件下可以治療腫瘤，也可以導致腫瘤的發生和發展，還需要大量研究來界定條件，排除矛盾。盡管對BMSCs的特性還缺乏認識，從研究到應用還有個過程，考慮到從1970年起，人們對BMSCs的研究才40余年就取得了豐碩的成果，形成了如下共識，BMSCs具有多向分化潛能和易于體外擴增，取材容易，易于基因操作，組織相容性好，是組織工程、基因工程、組織再生修復的理想種子細胞，可望廣泛用于腦缺血、心肌缺血等導致的組織損傷的修復、骨和軟骨組織的修復、1型糖尿病患者胰島細胞的分化、血液病和腫瘤疾病的治療、基因治療，中醫藥的引入拓寬了BMSCs研究的新領域，臨床應用前景廣闊。

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Research progress of bone marrow mesenchymal stem cells

YAN De-qi1,2YAN Ying-xuan3SUN Chao-yang4SONG Ji-zu5LUO Jin-bao6

1.Department of Basic Courses,Traditional Chinese Medicine College in Gansu Province,Lanzhou 730000,China;2.Huanghuai College in Henan Province,Zhumadian 463000,China;3.Hainan Medical University,Haikou 571199,China;4.the First People′s Hospital of Zhumadian City in Henan Province,Zhumadian 463000,China;5.Hydropower Four Hospital of Yongjing County in Gansu Province,Yongjing 731600,China;6.Zhonghe Township Hospital of Gaolan County in Gansu Province,Gaolan 730203,China

Bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)are non-hemopoietic adult stem cells existed in the bone marrow.BMSCs are multipotent in differentiation which has already been the hot spot in the basic and clinic medicine study both home and abroad.This article briefly overviews the concept,biological characteristics,cultivation,identification of BMSCs,and the recent home and abroad inducement and differentiation,tissue engineering,gene therapy,regeneration medicine study as well as their clinical prospects.

Bone marrow mesenchymal stem cells;Induce and dfferentiation;Tissue engineering;Chinese medicine

R392.12

A

1674-4721（2013）08(c)-0025-03

閆德祺（1967-），男，漢族，甘肅中醫學院基礎課部中西醫結合2011級碩士研究生，黃淮學院工程師和醫生，研究方向為干細胞和腫瘤

2013-01-24 本文編輯：郭靜娟）