聯用多重連接酶依賴探針擴增技術和基因測序技術檢測地中海貧血基因缺陷

黃國珍 張 莉 葉國永 吳朝暉 唋長順

1.廣東省深圳市坪山新區人民醫院檢驗科，廣東深圳 518118；2.廣州金域醫學檢驗中心，廣東廣州 511440

我國常見的遺傳性血液病有很多種，其中之一就是地中海貧血病。在我國，地中海貧血病的高發地區主要集中在廣東、廣西、海南和福建等省份。在世界范圍內保守估計[1]，有近2億人攜帶此病基因[2]，它已被世界衛生組織列為危害人類健康的6種常見病之一。如果夫婦雙方都攜帶地貧基因，按照基因重組定律，他們子女就會有25%的可能是重型地中海貧血，50%的可能是輕型地中海貧血，另有25%才屬于正常。按照現有的醫療技術水平，尚無有效治療地貧的方法，只有通過遺傳篩查和產前診斷才能有效杜絕重癥地貧患兒的出生[3]。本文回顧性分析了地中海貧血病患者110例，目的是聯用MLPA技術和基因檢測技術，對地中海貧血病患者進行基因診斷。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年10月～2013年2月來深圳市坪山新區人民醫院就診的地中海貧血病患者110例，其中男56例，女54例，年齡 21～56 周歲，平均（34±3.4）周歲。在110例地中海貧血病患者中，重型41例，輕型69例。

1.2 方法

1.2.1 基因測序 將目的基因聚合酶鏈式反應（polymerase chainreaction，PCR）擴增，具體為，PCR反應體系為每管10μL，提純的人體 DNA 樣本 1 μL，上下游引物各1μL，1μL 10×loading buffer，1 μL的酶，剩余量用 ddH2O 補足。PCR 反應程序為，92℃ 2 min，（92℃ 25 s，55℃ 15 s，72℃ 40 s）進行35個循環，最后4℃保存。再將基因擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結束后觀察，拍照。

1.2.2 MLPA檢測 根據MLPA試劑盒說明書步驟進行實驗。先進行PCR擴增，具體步驟為，PCR反應體系為每管10 μL，提純的人體 DNA 樣本 1 μL，上下游引物各 1 μL，1 μL 10×loading buffer，1 μL 的酶， 剩余量用 ddH2O 補足。PCR反應程序為，92℃ 2 min，（92℃ 25 s，55℃ 15 s，72℃ 40 s）進行35個循環，最后4℃保存。再取擴增產物2 μL加上甲酰胺和Ladder，加熱5 min，最后放在冰上10 min。最后進行電泳，時間為2 h。電泳完后用相關軟件進行分析。

2 結果

2.1 基因檢測結果

對110例基因進行檢測，α1型地中海貧血病21例，α2型地中海貧血病27例，β型地中海貧血病62例。在62例β型地中海貧血病患者中，21例（33.9%）合并α型地中海貧血病雙重雜合子，41例（66.1%）是41～42雜合基因型。

2.2 MLPA檢測結果

通過MLPA檢測檢測又發現16例（14.55%）α型地貧缺失型。因為通過普通的基因檢測結果所發現的地中海貧血病基因缺失型僅僅只能包括中國人的90%，再加上MLPA檢測，基本就能覆蓋全中國人。

3 討論

地中海貧血病屬于遺傳性疾病，主要由基因缺陷導致的，鑒于現有的醫療水平，徹底根治此病尚有難度。所有對于地中海貧血病的預防已經受到外國的重視。所以許多發達國家例如希臘、撒丁尼亞島、意大利和塞普路斯等從20世紀70年代起采取對地中海貧血病的預防措施，如普及地中海貧血病的病例知識，加強實施衛生教育、加大對地中海貧血病篩查力度等方法，很好地控制了地中海貧血病在這些國家的發病率。甚至在有些國家地中海貧血病發病率降低到了0%，比如在意大利，年輕夫婦從臨床醫生和衛生部門學習到關于遺傳風險的知識，從而能更好地選擇生育時機，降低了地中海貧血病的發病率。亞太地區如新加坡等也是地中海貧血病的重災區，這些國家學習歐洲先進的預防方法和干預手段，也大大降低了地中海貧血病的發病率，已經接近了0%。在中國，地中海貧血病高發地區是廣州，衛生部門已對此有了高度的重視，也制定了相關的預防措施，力圖最大程度地降低地中海貧血病的發病率。

預防地中海貧血病的關鍵就是能否有效地檢測和篩查出地中海貧血病缺陷基因的攜帶者[4]。一旦準確地檢測和篩查出地中海貧血病缺陷基因的攜帶者，就能指導他們進行合理的婚配和生育，就能預防地中海貧血病基因缺陷的胎兒出生，所以提高地中海貧血病缺陷基因的檢測和篩查水平有重要的意義。

血紅蛋白電泳與血液學篩查是診斷地中海貧血的常用方法[5]。如用這兩種方法發現地中海貧血的疑似病例，就再通過基因檢測的方法確定是否為地中海貧血病基因缺陷。這一些系列的方法準確度比較高，能發現中國人中90%的地中海貧血病基因缺失型。PCR法和反向斑點雜交技術是基因檢測中常用的兩種方法[6]。國際上檢測α型地中海貧血基因缺失的方法主要是單管多重PCR法，方法就是在一個PCR反應體系里加入多對反應引物，大概有3～4對，這樣能同時檢測多對等位基因，一般能同時檢測出3種地中海貧血病基因缺失，但對非缺失型基因，漏檢率較高。反響雜交發能檢測β型地中海貧血病的基因突變。這種方法能在同一張膜上同時檢測17～18對等位基因的突變，大大提高了工作效率，但漏檢率也不低，所以用PCR法和反向斑點雜交技術等基因檢測的方法還存在一定的漏洞，檢測率還不能達到100%。

據文獻報道，一種全新的檢測技術已問世，它就是多重連接酶依賴探針擴增法，它能在一個Eppendorf管里準確地檢測40多個基因序列[7]。現在已經將此種方法引入到地中海貧血基因檢測領域[8]，發現它能快速準確地檢測出β地中海貧血的基因缺失和α地中海貧血缺失型。

多重連接酶依賴探針擴增法的原理是這樣的，先設計出多對與目的序列互補的探針，它們一般能有效覆蓋真個目的序列[9]。再進行PCR擴增，得到40多種不同的DNA序列。最后進行電泳分析，檢測出缺陷基因。它的強大之處在于能同時檢測出所有的缺陷基因。對于檢測地中海貧血缺陷基因，多重連接酶依賴探針擴增法能同時檢測出α基因缺陷型和β缺陷型的基因[10]，而且運用這種方法能檢測到人類所有的β珠蛋白基因（HBB）和正常的血紅蛋白基因（HbA）突變，很好地彌補了血紅蛋白電泳、血液學篩查和PCR法[11]、反向斑點雜交技術這幾種方法的技術缺陷[12]。

通過本文的研究，發現運用基因測序技術能檢測到大部分的地中海貧血病，再聯用多重連接酶依賴探針擴增技術能更準確的檢測到全部地中海貧血病，所以聯用多重連接酶依賴探針擴增技術和基因測序技術是檢測地中海貧血病有效的方法，為以后的臨床檢測提供了依據。

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