影響ELISA檢測HBsAg結果的常見因素

吳肖仙 馮淦清

影響ELISA檢測HBsAg結果的常見因素

吳肖仙 馮淦清

目的分析酶聯免疫吸附試驗（ELISA）對表面抗原影響的常見因素，以提高實驗結果的準確性。方法使用ELISA法檢測HBsAg，對檢測步驟進行分析總結，分析可能存在影響檢測質量的因素和質控方法。結果血清標本、試劑盒、操作過程、結果數據分析等因素是影響ELISA檢測HBsAg結果的主要因素，加強實驗過程各環節的質量控制可以提高檢測準確度。結論ELISA方法檢測HBsAg影響因素較多，對于HBsAg陽性結果應重視復查，以確保檢驗結果的客觀性。

乙肝表面抗原；ELISA方法；影響因素；準確度

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記[1]。ELISA方法操作簡單、過程簡便，已成為檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的臨床常用手段，但在實際工作中該方法易存在多個影響結果準確性的因素，筆者分析ELISA影響HBsAg檢測的常見因素，具體情況匯報如下。

1 血清標本

檢驗科技術人員在標本檢測前應先觀察血液樣本，部分不符合測試要求的血液樣本應重新抽取，如乳糜血、嚴重黃疸等樣本可能因為血清黏稠度高，使抗原反應在一定程度上受到屏蔽，導致假陰性結果的出現。杜絕血液的生理特性，室溫下第9天，4～8℃第14天后血液標本將出現溶血現象，具有酶活性的血紅蛋白大量出現，導致出現假陽性結果。相同原理，溶血標本應重新抽取。血液抽取后，待血液充分凝固后應及時分離血清，如分離不完全，血清標本中參雜纖維蛋白，結果會出現假陽性。故筆者認為血液標本應及時充分分離，及時檢測，如若條件不足未能及時檢測，則應當將標本充分分離后置于低溫冰箱中。血清標本禁反復凍溶。

2 試劑

不同生物試劑公司的ELISA試劑盒存在敏感度、特異性的差別，檢驗設備亦要求配套的試劑盒參數，以保證檢測質量。試劑盒購買后應置于4℃～6℃環境，每批次新進試劑應在使用前作質量控制，如空白試驗、陰陽性對照、臨界陽性標本檢驗等。在檢測前要室溫中平衡20min后再行測定，該步驟可使反應微孔內的溫度迅速達到所需溫度，利于后續測定。剩余的試劑應繼續保存于4℃～6℃環境，下次檢測前應仔細檢查試劑是否變質，過期產品不予繼續使用。

3 操作因素

ELISA操作過程包括加樣、孵育、洗板、顯色四個主要步驟。ELISA試劑盒在室溫下平衡溫度20min后，操作者將事先校準的移液槍進行手工加樣，加樣量應盡量準確均一，加樣過程中移液器應垂直使用，不接觸包被板底部，使檢測樣品均處于加樣板的包被區域，操作過程中不允許樣品濺出或有氣泡產生。如果使用自動加樣儀進行上樣，為了保證足夠的加樣量，應選用帶有指示劑稀釋試劑作為樣品加注與否的監測指示。儀器責任人應當定期校準儀器，加強實驗重復性的準確度。

加樣結束后進行樣本孵育，孵育時間對檢測結果的準確性有重要影響，根據生理特性，HBsAg孵育溫度為37℃，孵育時間根據不同試劑盒有不同的要求，操作應嚴格按照試劑盒說明書進行。為了最大程度降低實驗的邊緣效應，HBsAg孵育應采取水浴，并將96孔板用封膜緊密封閉，避免其他污染物對樣本造成污染而影響結果。使用的恒溫水浴箱溫度準確、恒定，每天記錄溫度，放樣本孵育前應先觀察溫度。

孵育完成后對測試孔板進行洗滌，采用新鮮配制的洗滌液，其配制過程嚴格按照說明書進行。洗滌液清洗測試板過程中分離結合與未結合的抗原抗體復合物及酶標記物，將孔板內非特異性吸附的蛋白質、血球中酶成分徹底清除，減少干擾，鑒于血清中殘留的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞狀態，造成未結合標記酶洗脫不徹底，故筆者建議每日清洗洗板機以確保結果準確性，且每次洗板次數不低于6次。

洗板完成后進行顯色操作，使用試劑盒配套的顯色液進行顯色，顯色終止15min內酶標儀讀數，酶標儀應避光操作，且操作前應事先預熱10min。

4 數據分析

抗原抗體特異性反應時，生成結合物的量與反應物的濃度有關。無論在一定量的抗體中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗體，均可發現只有在兩者分子比例合適時才出現最強的抗原-抗體反應；由于抗原抗體比例不合適而導致假陰性的現象叫鉤狀效應。ELISA測試過程中由于血清中HBsAg濃度過高、血液黏稠度高、血脂高等容易出現鉤狀效應而影響結果，故應將檢測結果同臨床診斷相結合，做出數據的最后判讀。

5 討論

ELISA其操作原理是根據結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析，以了解被測標本中抗體或抗原含量[2-3]。

ELISA方法因操作簡單、價格低廉而被廣泛運用，但其加樣、溫度、孵育時間、洗板、顯色等因素的影響，導致有一定的假陽性或假陰性結果，給臨床結果判讀帶來一定程度的影響。本文通過對ELISA影響因素分析和總結，針對性進行質量控制，減少或避免人為因素影響，提高結果準確性；對于HBsAg陽性結果應重視復查，以確保檢驗結果的客觀性。

[1] 葉千紅,張麗霞.關于標本因素對ELISA檢測結果影響的分析[J].中國實驗診斷學,2003,7(5)：440-441.

[2] 張蕾,周晶珠,王立.乙型肝炎分子生物學檢驗方法的應用及質量控制[J].中國現代醫生,2009,47(14)：98-99.

[3] 杜艷霞.酶聯免疫吸附試驗測定操作的體會[J].中國實用醫藥,2009,4(27)：139-140.

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1673-5846(2013)01-0331-02

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