抑郁大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的實(shí)驗(yàn)觀察研究

馬江波楊治明

抑郁大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的實(shí)驗(yàn)觀察研究

馬江波1楊治明2

目的研究長(zhǎng)期應(yīng)激刺激的未成年鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化。方法選取未成年大鼠32只，分為模型組16只（增殖組和分化組各8只）和對(duì)照組16只（增殖組和分化組各8只），利用三重免疫熒光染色技術(shù)觀察海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化情況。結(jié)果海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況為模型組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少（P＜0.05）；兩組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的分化無(wú)明顯差異性（P＞0.05）。結(jié)論抑郁癥與未成年大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖有相關(guān)性，可致增殖降低。

未成年抑郁癥；海馬；神經(jīng)干細(xì)胞；增殖；分化

抑郁癥是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重危害人們身心健康的精神障礙疾病。在我國(guó)，各類(lèi)精神障礙患者已超過(guò)8300萬(wàn)人，而在各種精神疾患中，抑郁癥的致死率排名首位。專(zhuān)家預(yù)計(jì)，到2020年抑郁癥將可能成為繼癌癥之后人類(lèi)的第二大殺手[1]。青春期抑郁癥是一種常見(jiàn)精神科疾病，表現(xiàn)為情緒低落、注意力不集中、精力下降、悲觀絕望、無(wú)助等癥狀，嚴(yán)重抑郁可導(dǎo)致長(zhǎng)期生理、心理等一系列問(wèn)題的出現(xiàn)[2]。有研究結(jié)果表明，青少年抑郁癥發(fā)病率為 8.3%[3]，而我國(guó)青少年大約有37%伴有不同程度的心理問(wèn)題[1]，嚴(yán)重影響青少年的身心健康、學(xué)習(xí)以及成長(zhǎng)，且增加了社會(huì)與家庭負(fù)擔(dān)，近年來(lái)的諸多研究證實(shí)，應(yīng)激性事件是抑郁癥的明顯促發(fā)因素，慢性、低強(qiáng)度、長(zhǎng)期的日常壓力是引發(fā)抑郁的主要原因[4]。目前國(guó)內(nèi)外廣泛采用應(yīng)激（尤其是慢性輕度不可預(yù)見(jiàn)的應(yīng)激）模擬造成抑郁癥的壓力源來(lái)制作抑郁動(dòng)物模型，其機(jī)理與人類(lèi)抑郁癥發(fā)病機(jī)理相接近。而與學(xué)習(xí)、記憶、情感的生理功能密切相關(guān)的海馬組織也會(huì)受其影響，在形態(tài)體積等方面發(fā)生變化[5]。本實(shí)驗(yàn)利用長(zhǎng)期不可預(yù)見(jiàn)性刺激結(jié)合孤養(yǎng)造成未成年大鼠抑郁模型，并利用三重免疫熒光染色技術(shù)研究長(zhǎng)期應(yīng)激刺激的未成年大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化，以期了解未成年抑郁大鼠在應(yīng)激狀態(tài)下海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的情況。

1 資料與方法

1.1 研究方法實(shí)驗(yàn)分為模型組16只，分為增殖組和分化組各8只；對(duì)照組16只，分為增殖組和分化組各8只。模型組大鼠單籠飼養(yǎng)，共接受為期21天的不同刺激，其中包括電擊足底（電流強(qiáng)度1mA，電壓45v，每隔1min刺激1次，每次持續(xù)10s，共30次）；搖晃（每秒1次，15min）；冰水強(qiáng)迫游泳（4℃，5min）；熱水刺激（45℃，5min）；夾尾（1min）；禁水（24h）；禁食（24h），睡眠剝奪（48h）；常溫強(qiáng)迫游泳（5min）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天給予一到兩種，整個(gè)模型制造過(guò)程中每種刺激至少給予2次，同一種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生。對(duì)照組不接受任何刺激，自由攝食飲水。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單只獨(dú)籠飼養(yǎng)，對(duì)照組群養(yǎng)，刺激在另一個(gè)房間內(nèi)給予，該房間的光照、溫度基本與飼養(yǎng)間一致，刺激完畢后送回飼養(yǎng)間。

1.2 組織處理增殖組在應(yīng)激刺激完成 24h后給藥，BrdU（100mg/kg），腹腔注射，注射后存活24h，灌注固定，取腦組織。分化組在應(yīng)激刺激完成 24h后給藥，BrdU（100mg/kg），腹腔注射，注射后存活4周，灌注固定，取腦組織，分別經(jīng)10%、20%蔗糖磷酸鹽緩沖液脫水處理后取出海馬中后部分（約2mm），液氮冷凍后-80℃保存。

1.3 免疫熒光檢測(cè)技術(shù)分析將固定的海馬組織利用全自動(dòng)振動(dòng)切片儀（LEICA TV1000S）沿冠狀斷面連續(xù)切片，片厚50μm，每只動(dòng)物取10張切片進(jìn)行染色。增值組用抗BrdU熒光抗體標(biāo)記，顯微鏡下計(jì)數(shù)；分化組用三重免疫熒光染色，抗BrdU/NeuN/S100β分別標(biāo)記陽(yáng)性顆粒細(xì)胞（紅色）、神經(jīng)細(xì)胞（藍(lán)色）和膠質(zhì)細(xì)胞（綠色），顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析建立 Excel數(shù)據(jù)庫(kù)，采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)數(shù)資料差異性比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬 BrdU陽(yáng)性細(xì)胞增殖情況模型組未成年鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況顯示，模型組（11.40±4.68），對(duì)照組（25.36±11.42），模型組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少，與對(duì)照組比較存在明顯差異（P＜0.05）。

2.2 海馬BrdU陽(yáng)性細(xì)胞分化情況海馬BrdU陽(yáng)性細(xì)胞分化的定量結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組無(wú)明顯差異，兩組轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的比例分別為 89%和88%，轉(zhuǎn)化為膠質(zhì)細(xì)胞的比例分別為10%和9%。

3 結(jié)論

海馬是邊緣系統(tǒng)重要組成部分，是下丘腦-垂體-腎上腺軸應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞，在情緒、學(xué)習(xí)、記憶以及行為、免疫等方面都具有調(diào)節(jié)功能。海馬組織的損傷在各種應(yīng)激所致的抑郁癥模型中起到關(guān)鍵作用[6,7]。研究表明，長(zhǎng)期的應(yīng)激刺激能使機(jī)體產(chǎn)生學(xué)習(xí)和記憶障礙、精神紊亂、癡呆、加速衰老、免疫力低下等多系統(tǒng)疾患，而這些疾患無(wú)一不是與下丘腦-垂體-腎上腺軸持續(xù)亢進(jìn)，血中糖皮質(zhì)激素水平升高密切相關(guān)。有MRI研究變明，重癥抑郁患者雙側(cè)海馬體積較之正常者顯著減小，且減小程度與抑郁持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)，這可能與高濃度皮質(zhì)酮誘導(dǎo)單胺能神經(jīng)元糖皮質(zhì)激素受體下調(diào)，腦海馬神經(jīng)元減少有關(guān)，因?yàn)樘瞧べ|(zhì)激素有神經(jīng)元毒性[8,9]。成年哺乳動(dòng)物海馬腦區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的降低是導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生的重要因素，抑郁癥的發(fā)病機(jī)理有可能是各種應(yīng)激最終抑制或減緩了海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖[8,9]。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性不可預(yù)見(jiàn)性中等強(qiáng)度應(yīng)激后海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較正常對(duì)照組明顯下降，細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)發(fā)生被抑制，電鏡觀察示神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受損[9]。

本實(shí)驗(yàn)觀察到模型組未成年抑郁大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少，但細(xì)胞分化未見(jiàn)明顯改變。對(duì)未成年抑郁癥患者海馬腦區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與抑郁癥的關(guān)聯(lián)性?xún)H進(jìn)行了有力的證據(jù)補(bǔ)充，但由于實(shí)驗(yàn)樣本、方法和技術(shù)的限制，闡明長(zhǎng)期應(yīng)激刺激、抑郁和海馬組織內(nèi)干細(xì)胞增值降低三者之間的因果關(guān)系還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究加以探索。

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R749

A

1673-5846(2013)09-0168-02

1寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，寧夏銀川 750004

2寧夏石嘴山市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，寧夏石嘴山 753000