小鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)及生物學(xué)特性*

辛 毅，許秀芳，黃益民，張 穎，李溫斌，李 娜

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京市心肺血管疾病研究所分子生物學(xué)研究室，北京100029)

近年來大量研究表明，心肌微血管內(nèi)皮細胞(myocardial microvascular endothelial cells，MMVECs)的功能和病理改變直接影響心肌細胞功能，也是諸多毒素、炎癥因子及病毒等重要靶位［1］，其作為體外研究的細胞模型在心肌缺血/再灌注發(fā)病機制和細胞間旁分泌細胞生長因子研究中起著重要作用［2］。國內(nèi)已廣泛開展大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)技術(shù)［3-4］，而小鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)技術(shù)的研究較少，其難點在于小鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)方法要求極高。如何建立一種比較簡單、快速有效的方法，盡可能地獲得較高活力及存活率的細胞，仍是細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵。本研究摸索出一種簡便、可靠、穩(wěn)定的Ⅱ型膠原酶消化分離、經(jīng)差速貼壁再結(jié)合內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基、以多聚賴氨酸對培養(yǎng)皿作預(yù)包被培養(yǎng)出純度較高、結(jié)構(gòu)和功能良好的MMVECs的方法，為心血管疾病的體外研究提供了更有效的技術(shù)手段和較理想的靶細胞模型，并對其基本生物學(xué)特性進行了初步觀察，為今后細胞培養(yǎng)起到了一定的指導(dǎo)作用。

材料和方法

1 動物

SPF級C57BL/6乳小鼠，雌雄不限，1～3日齡，體質(zhì)量1.2～1.5 g，來源于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK(京)2006-009。

2 主要試劑

高糖/DMEM培養(yǎng)基(high glucose/DMEM，HG/DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素和鏈霉素均為Gibco產(chǎn)品;內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM)為ScienCell產(chǎn)品;Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶和多聚賴氨酸均為Sigma產(chǎn)品;MTT為Promega產(chǎn)品;波形蛋白(vimentin)兔抗小鼠(Ⅰ抗，Santa Cruz)、兔抗小鼠vWF相關(guān)抗原多克隆抗體、兔抗小鼠CD31及CD34多克隆抗體(Ⅰ抗，Santa Cruz);FITC標記的羊抗兔IgG及TRITC標記的羊抗兔IgG(Ⅱ抗，Jacson);細胞培養(yǎng)板、離心管、培養(yǎng)皿等耗材購自Corning。

3 主要方法

3.1 取材 將乳鼠于體積分數(shù)75%乙醇缸中浸泡10 s，轉(zhuǎn)移至超凈臺。將乳鼠固定于左手掌中，右手用無菌棉簽沾體積分數(shù)75%乙醇消毒胸、腹部皮膚3次。用眼科虹膜剪在劍突處正中線稍偏左向上開胸后，用剪子壓住胸骨右緣，使心臟自然跳出，用彎鑷子勾住心尖根部，取出心臟，置于盛預(yù)冷0.01 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)的培養(yǎng)皿中。將鼠心臟全部取出后，剪去心房、剔除心臟上結(jié)締組織、脂肪及血管，于預(yù)冷0.01 mol·L－1PBS(含雙抗)清洗3次，去除血污。將心臟剪成約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，備用。

3.2 MMVECs酶消化分離培養(yǎng)法 將組織碎塊放入50 mL離心管中，再加入2 g·L－1Ⅱ型膠原酶消化，消化液體積為心肌組織的10～15倍，同時加入FBS 1 滴，置37 ℃、80 r·min－1水浴搖床消化40 min后，吸管輕輕吹打組織塊2 min分散細胞，此時消化液變混濁，大部分組織塊變成白色，用吸管吸取細胞懸液放入15 mL離心管中，加入含體積分數(shù)10%FBS HG/DMEM終止消化，收獲細胞，所有的細胞懸液過200目銅網(wǎng)。

3.3 MMVECs細胞培養(yǎng) 吸取細胞懸液入15 mL離心管，1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，細胞沉淀中加入含體積分數(shù)10%HG/DMEM 8 mL，吹打均勻后放入100 mm培養(yǎng)皿，置體積分數(shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，放置60 min差速貼壁，最先貼壁為心肌成纖維細胞，將未貼壁的細胞懸液(含有心肌微血管內(nèi)皮細胞及心肌細胞)收集到15 mL離心管中，1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，加入 ECM 培養(yǎng)基重懸細胞，置于100 mm多聚賴氨酸預(yù)包被培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

3.4 MMVECs分離純化及傳代培養(yǎng) 在細胞培養(yǎng)中，依據(jù)心肌成纖維細胞和心肌微血管內(nèi)皮細胞貼壁時間不同的原理進行差速分離，心肌成纖維細胞貼壁較早且生長迅速，經(jīng)過體外長時間的消化及內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基的應(yīng)用，心肌細胞基本死亡。待MMVECs生長到培養(yǎng)皿的50% ～60%時，加入0.01 mol·L－1PBS 洗2 次，用 2.5 g·L－1胰蛋白酶消化，在顯微鏡下觀察消化程度，細胞形態(tài)由緊密貼壁橢圓形逐漸變成圓形，加入ECM培養(yǎng)基終止消化，把細胞懸液收集到15 mL離心管中，1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，加入ECM培養(yǎng)基1∶3傳代。

3.5 MTT測定MMVECs增殖活力 取第1、3、5代處于對數(shù)生長期的細胞，以每孔約2×104個細胞等量接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。每24 h向其中5孔加入20 μL MTT溶液，置于37℃、5%CO2孵育3 h后，用酶標儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度值(A490)，每天測5孔，連續(xù)測7 d。設(shè)立平行對照孔(加入培養(yǎng)液，不加細胞)并調(diào)零，測定MMVECs增殖及存活能力。

3.6 生長曲線的測定 取第1、3、5代處于對數(shù)生長期的細胞，按2×107/L接種于24孔培養(yǎng)板，每孔接種500 μL。從接種時間算起，每24 h計數(shù)3孔內(nèi)的細胞密度，算出平均值，共記7 d。以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標，細胞密度為縱坐標作生長曲線。

3.7 MMVECs體外血管形成實驗 4℃冰上融化Matrigel膠，每孔150 μL均勻加至24孔板，不要有氣泡，靜置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱孵育3 min后，待凝固后每孔逐漸緩慢加入200 μL細胞懸液，內(nèi)含MMVECs為 3×105cells/well。在倒置顯微鏡下觀察其體外血管形成過程。

3.8 MMVECs免疫熒光法鑒定

3.8.1 MMVECs DiI-ac-LDL 和 FITC-UEA-1 雙熒光染色 細胞爬片上細胞長滿約80%后鑒定，細胞在含DiI-ac-LDL(10 mg·L－1)的培養(yǎng)液中避光孵育4 h，PBS漂洗后，用 40 g·L－1的多聚甲醛固定 30 min，PBS漂洗后再加 FITC-UEA-1(10 mg·L－1)避光孵育1 h，PBS漂洗后，DAPI染核10 min，在熒光顯微鏡下觀察，顯示紅色熒光的為DiI-ac-LDL陽性細胞，顯示綠色熒光的為UEA-1陽性細胞，藍色為細胞核，顯示雙熒光陽性(黃色)的細胞被認為是MMVECs。隨機計數(shù)10個非重疊視野，計算雙陽性細胞比例。

3.8.2 MMVECs vWF、CD31 和 CD34 抗原的鑒定

取第3代MMVECs以1×105個接種于放有無菌蓋玻片的24孔板，2～3 d后用0.01 mol·L－1PBS洗3次，每次 2 min;40 g·L－1多聚甲醛固定 20 min，0.01 mol·L－1PBS 洗3 次，每次2 min;3 g·L－1Triton X-100室溫孵育30 min，用0.01 mol·L－1PBS洗3次，每次2 min;200 μL胎牛血清室溫封閉1 h，滴加200 μL兔抗小鼠 vimentin、CD31、vWF和 CD34(Ⅰ抗;1∶100)，4 ℃過夜，用0.01 mol·L－1PBS 洗 3 次，每次2 min;然后分別加1∶100 TRITC標記或FITC標記的羊抗兔IgG(Ⅱ抗)200 μL，室溫避光孵育1 h，用0.01 mol·L－1PBS洗3次，每次2 min;最后用DAPI染核，室溫避光孵育15 min;同時做同型對照，不加Ⅰ抗，余步驟同前，在熒光顯微鏡下觀察，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MMVECs形態(tài)特征及生長特點

MMVECs酶消化分離細胞，細胞于24 h后貼壁，胞質(zhì)完全伸展，見圖1A;第3 d細胞開始生長，呈三角形、不規(guī)則型，見圖1B;第4～5 d細胞開始增殖，可見多數(shù)核分裂像，細胞密度迅速增大，見圖1C、D;第6～7 d后長成致密細胞層，呈短梭形、多角形，為鋪路石樣排列(圖1E、F)，MMVECs純度為(91.0±3.8)%以上。

Figure 1.Primary culture of MMVECs.A:day 2;B:day 3;C:day 4;D:day 5;E:day 6;F:day 7.圖1MMVECs的原代培養(yǎng)

2 MMVECs傳代細胞成活率

臺盼藍法計數(shù) MMVECs，1 000個細胞中，(95.0±2.6)%的細胞未著色，即細胞的成活率為95%以上，表明培養(yǎng)的細胞消化傳代成活率高。

3 MMVECs生長曲線

從生長曲線上看，第1、3代細胞接種3 d后，細胞數(shù)明顯增加，第3～4 d為對數(shù)生長期，5 d后細胞數(shù)量減少，呈現(xiàn)“潛伏期——對數(shù)生長期——停滯期”的生長模式，見圖2;第5代細胞接種后無明顯變化，細胞數(shù)無明顯增加。

Figure 2.The growth curves of MMVECs in the first，third and fifth passages.圖2 MMVECs第1、3、5 代生長曲線

4 MMVECs增殖活力

取第1、3、5代對數(shù)期生長的細胞，MTT法連續(xù)7 d測定MMVECs增殖能力，結(jié)果見表1。第1代與第3代比較，MMVECs生長前2 d無明顯增殖，提示此段時間內(nèi)MMVECs增殖能力較弱;3～5 d變化比前2 d較為顯著(P＜0.05)，提示此段時間內(nèi)細胞出現(xiàn)增殖;6～7 d變化比3～5 d有顯著差別(P＜0.05)，提示此段時間內(nèi)細胞出現(xiàn)衰老，與MMVECs生長曲線結(jié)果相一致，故認為第3～5 d為傳代的最佳時機。第5代細胞無明顯增殖，增殖能力較弱，活力較弱。

5 體外血管形成實驗

MMVECs接種于基質(zhì)膠后，細胞2 h后即可貼壁、黏附，4～6 h形成分散的網(wǎng)狀及管腔結(jié)構(gòu)，管腔周圍聚集單層細胞，其數(shù)量逐漸增多，見圖3A，10～12 h網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相互連接，形成小管腔樣結(jié)構(gòu)，見圖3B。

表1 第1、3、5代小鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞增殖活力測定Table 1.Viability of MMVECs in the first，third and fifth passages(mean±SD.n=5)

Figure 3.Dynamic process of the tube formation of MMVECs plated on Matrigel.A:6 h;B:12 h.圖3 體外血管形成的動態(tài)過程

6 DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色鑒定

熒光顯微鏡下觀察，MMVECs的DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色陽性率(89.2±3.5)%，見圖4。

Figure 4.Identification of MMVECs by DiI-ac-LDL and FITCUEA-1 immunofluorescent staining(×1 000).A:DiI-ac-LDL;B:FITC-UEA-1;C:DAPI;D:merged.圖4MMVECs DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色鑒定

7 CD31、vWF和CD34免疫熒光鑒定

倒置顯微鏡下觀察CD31、vWF和CD34染色陽性率分別為(56.7±3.7)%、(78.5±2.6)%和(67.8±4.2)%，見圖5;vimentin陰性表達。

Figure 5.Identification of MMVECs by CD31，vWF and CD34 immunofluorescent staining(×400).A:CD31;B:vWF;C:CD34.圖5MMVECs CD31、vWF和CD34免疫熒光鑒定

討 論

血管內(nèi)皮細胞位于血管腔內(nèi)膜表面，為單層緊密排列，互相連接的一層薄膜，構(gòu)成了一道循環(huán)血液與局部組織之間的屏障，目前血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)大多數(shù)來源于大血管內(nèi)皮細胞，而大血管內(nèi)皮細胞與微血管內(nèi)皮細胞無論在分泌功能及調(diào)節(jié)體內(nèi)各種生物信息的應(yīng)答和生理功能等方面均存在著明顯的差異，微血管內(nèi)皮細胞具有顯著的組織器官異質(zhì)性［5］。因此，如何簡便、成功地獲得純度較高的心肌微血管內(nèi)皮細胞是如今進行心血管疾病研究的一個突破點。

原代培養(yǎng)常用的方法有酶消化法和組織塊法:Nishida等［6］報道了一種通過心臟灌注、膠原酶和胰蛋白酶消化及機械剪切的方法，但該方法需要特殊的實驗設(shè)備，步驟較復(fù)雜、費時，雖然該方法培養(yǎng)周期短，但酶活性濃度、酶作用時間不易掌握，培養(yǎng)不易成功。目前國內(nèi)實驗室已經(jīng)廣泛開展大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)，常采用組織貼塊培養(yǎng)法，需在手術(shù)顯微鏡下操作，對操作環(huán)境要求較高，體外培養(yǎng)細胞周期較長，且同時出現(xiàn)上皮細胞和成纖維細胞混雜生長。對小鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)仍有一定難度，本研究首次應(yīng)用以多聚賴氨酸對培養(yǎng)皿作預(yù)包被，Ⅱ型膠原酶消化經(jīng)差速貼壁分離法結(jié)合內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基，簡便、成功地獲得純度較高的心肌微血管內(nèi)皮細胞。

本研究選用Ⅱ型膠原酶消化，此酶特異性作用于結(jié)締組織的膠原，對膠原或細胞間質(zhì)有很好的消化作用，減輕了對細胞的損傷程度，更使其內(nèi)的細胞容易遷出，但長時間的消化會影響心肌細胞的活力，本研究采用Ⅱ型膠原酶40 min消化，可以消除心肌細胞的污染;依據(jù)心肌成纖維細胞貼壁速度很快，而心肌微血管內(nèi)皮細胞相對較慢，通過差速貼壁60 min，可以有效地分離心肌成纖維細胞［7］和心肌微血管內(nèi)皮細胞;此外，本研究在培養(yǎng)基質(zhì)中用多聚賴氨酸對培養(yǎng)皿進行預(yù)包被，而沒有使用鼠尾膠原或纖維連接蛋白，多聚賴氨酸作為一種中介蛋白，促進細胞連接到膠原等細胞外基質(zhì)上，在MMVECs的體外培養(yǎng)中主要起到促進貼壁的作用。本研究使用了多聚賴氨酸預(yù)包被培養(yǎng)皿，也能發(fā)揮與鼠尾膠原、纖維連接蛋白相同的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種培養(yǎng)方法也能獲取較多的MMVECs，使其成本大大減低且簡化操作程序;體外培養(yǎng)MMVECs并結(jié)合內(nèi)皮專用培養(yǎng)基的應(yīng)用，可以選擇性地培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞，減少心肌細胞及心肌成纖維細胞的混雜生長，為該細胞體外培養(yǎng)創(chuàng)造適宜的環(huán)境，為進一步探討心臟微環(huán)境生理及病理改變的研究提供了實驗基礎(chǔ)。

研究MMVECs增殖能力有助于更多地了解其生長特性［8］。本研究采用2種指標即細胞生長曲線、細胞增殖活力(MTT)來反映細胞的生長增殖能力。

細胞生長曲線是一定數(shù)量的細胞在一定空間的培養(yǎng)皿中貼壁生長的細胞數(shù)與時間的關(guān)系曲線。本研究通過細胞計數(shù)法繪制第1、3、5代細胞生長曲線，結(jié)果顯示第1、3代細胞生長曲線近似“S”形，潛伏期約2 d;2 d后進入對數(shù)生長期，此時細胞增殖最為迅速，可用于實驗研究;5 d后進入停滯期，細胞數(shù)量很多但細胞分裂卻近乎停止，細胞處于生長抑制期，細胞不能應(yīng)用于實驗;第5代細胞無明顯增殖且逐漸凋亡甚至死亡，此時已經(jīng)進入衰退期，因此最好不要超過5d進行傳代，MMVECs在體外培養(yǎng)傳代次數(shù)有限且3代內(nèi)的細胞可用于實驗。

MTT法檢測第1、3、5代細胞增殖活力的結(jié)果顯示，第1、3代細胞吸光度值(A490)在細胞傳代后3～5 d增長較快，表明此時間內(nèi)MMVECs增殖活力較強。第5代MMVECs幾乎無增殖。從上述結(jié)果可以顯示，第3代以內(nèi)的MMVECs在體外傳代3～5 d可作為理想的實驗細胞，與生長曲線相一致。

大量研究證明微血管內(nèi)皮細胞在生理與病理過程中起著非常重要的作用［2，9］，當機體創(chuàng)傷、缺血、缺氧及炎癥反應(yīng)時，內(nèi)皮細胞及蛋白酶激活后，基質(zhì)降解和內(nèi)皮細胞的黏附、遷移、增殖、分化成毛細血管的過程，體外管腔形成實驗是血管內(nèi)皮細胞在基質(zhì)膠上形成具有管腔的毛細管狀結(jié)構(gòu)，涉及微血管內(nèi)皮細胞功能，接近體內(nèi)血管新生的機制，本研究將心肌微血管內(nèi)皮細胞接種于預(yù)包被的基質(zhì)膠上，結(jié)合ECM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)6～12 h可以形成毛細血管樣網(wǎng)絡(luò)和血管樣結(jié)構(gòu)，建立血管發(fā)生的實驗?zāi)Ｐ蛠碓u價抗血管藥物的療效及相關(guān)的分子調(diào)控機制。

關(guān)于內(nèi)皮細胞的表面抗原有多種方法的鑒定，由于CD34、vWF和CD31被認為是內(nèi)皮細胞的特征性表面標志，CD34和CD31主要表達于血管內(nèi)皮細胞表面［10-11］;血管性血友病因子(vWF)作為內(nèi)皮細胞合成和分泌的一種糖蛋白，反映內(nèi)皮細胞的功能狀態(tài)和損傷程度的指標［12］，本研究通過對培養(yǎng)MMVECs進行CD31、vWF和CD34免疫熒光鑒定，結(jié)果顯示，細胞大多數(shù)陽性表達CD31、vWF和CD34且vimentin表達陰性，其陽性率分別為(56.7±3.7)%、(78.5±2.6)%和(67.8±4.2)%。培養(yǎng)的MMVECs經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，在融合成單層后呈鋪路石樣，符合血管內(nèi)皮細胞特殊的生長形態(tài)，因此，通過細胞形態(tài)學(xué)及表型鑒定，可以認為這些細胞都是比較純的MMVECs，而且基本排除了心肌成纖維細胞的干擾。

目前國內(nèi)外最常用的內(nèi)皮細胞的鑒定金標準為DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I雙染色法鑒定［13］。吞噬ac-LDL雖然是內(nèi)皮細胞的特征之一，但是吞噬細胞也具有此特征。為進一步區(qū)分二者，同時行凝集素鑒定。凝集素是從植物或無脊椎動物中提取的糖蛋白，不同種屬的凝集素能和細胞表面的特定糖基特異性結(jié)合，從而作為細胞鑒定標志，荊豆凝集素I(UEA-I)能與內(nèi)皮細胞表面糖基特異性結(jié)合。因此本研究對所分離的細胞進行DiI-ac-LDL和FITCUEA-I雙染色鑒定，結(jié)果顯示(89.2±3.5)%陽性細胞，即可確定為內(nèi)皮細胞。

綜上所述，本實驗首次以多聚賴氨酸對培養(yǎng)皿作預(yù)包被，Ⅱ型膠原酶消化、經(jīng)差速貼壁分離法結(jié)合內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基，簡便、成功地獲得純度較高的新生小鼠MVECs。通過臺盼藍染色表明傳代細胞成活率高達95%以上;經(jīng)繪制細胞生長曲線和MTT法分別觀察MMVECs生長、增殖特性;DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1熒光雙標及細胞表面相關(guān)抗原CD31、vWF和CD34免疫熒光染色法鑒定，體外管腔形成實驗進一步證實為MMVECs。本研究為建立穩(wěn)定的MMVECs細胞系提供了方法，并為以MMVECs作為靶細胞，從細胞分子水平研究心血管疾病病因、機制和防治提供實驗基礎(chǔ)。

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