RICTOR對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞活力的影響*

郭 欣， 胡愛玲， 方霖楷， 劉 巖， 潘云峰△

(中山大學附屬第三醫院1風濕免疫科，2護理部，廣東 廣州510630)

類風濕關節炎 (rheumatoid arthritis，RA)是一種病因尚未明了的慢性全身性炎癥性疾病，世界上約0.5%～1%的人群患有RA。滑膜炎癥細胞浸潤以及襯里層增生是其典型病理表現。襯里層增生的滑膜細胞可分為巨噬樣滑膜細胞和成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)。其中 RA-FLS 具有增殖程度增高、侵襲等類腫瘤特性，并發現多個與腫瘤發生密切相關的信號轉導系統，如絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路、Wnt/β-catenin通路、核因子 κB(nuclear factorkappa B，NF-κB)通路與磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/Akt)通路等，都與 RA的發病、關節破壞和疾病的進程有著密切關系［1-3］。但目前有關其生物學特性及變化機制尚未清楚。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可整合營養、能量及生長因子等多種細胞外信號，參與細胞存活、增殖、分化等。mTOR共有mTORC1和mTORC2兩種復合物。mTORC2可磷酸化Akt的Ser473位點，是Akt激活的必要條件，并且與多種腫瘤細胞的幸存、增殖、遷移有關。已有學者發現Akt通路在RA-FLS可被多種細胞因子激活，并參與減弱滑膜細胞對Fas引起的凋亡的敏感性［4］。而作為Akt激活的必要條件，目前尚未見mTORC2與RA的相關報道。RICTOR(rapamycin-insensitive companion of mTOR)為mTORC2特異性的組成蛋白，并是其發揮生物學作用的必不可少的組成部分［5］。本研究通過siRNA介導的RNA干擾技術沉默RAFLS中RICTOR的表達，觀察mTORC2對細胞存活的影響。

材料和方法

1 標本采集

類風濕關節炎患者滑膜組織來自2010年3月至2012年6月中山大學附屬第三醫院行滑膜清理術或關節置換術，共7例，其中5個取自膝關節、2個取自髖關節。年齡25～62歲，平均40.1歲，其中6名女性。所有RA患者診斷均符合1987年美國風濕病學會(American Rheumatism Association，ARA)類風濕關節炎分類標準。

2 主要試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及高糖DMEM無血清培養基購自Thermo scientific;RNAiso Plus(總RNA提取試劑)、SYBR? Premix Ex TaqTMII(Perfect Real Time)及 PrimeScript? RT reagent Kit(Perfect Real Time)均購自TaKaRa寶生物工程(大連)公司;總蛋白提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;靶I抗:兔抗人抗RICTOR多克隆抗體購自Cell Signaling;兔抗人抗磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體購自Bioworld;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記 II抗購自 Immunology Consultants Laboratory;噻唑藍(四甲基偶氮唑鹽)購自MP Biomedicals;無血清培養基 Opti-MEM I、脂質體 Lipofectamine? RNAiMAX均為 Invitrogen產品。所需siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并化學合成，RICTOR的siRNA序列:正義鏈5'-GCGGUUAGCUUUAUUAAAUTT-3'，反義鏈 5'-AUUUAAUAAAGCUAACCGCTT-3';非特異siRNA(陰性對照)序列:正義鏈5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反義鏈5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

3 方法

3.1 細胞培養與鑒定 滑膜組織經無菌條件下處理后，向滑膜組織滴加PBS緩沖液，將其銳性剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm大小，將組織塊移至培養瓶中，加入適量10%FBS培養液，置于5%CO2、37℃培養箱中培養。根據細胞的生長情況及培養液的變化，每2～3 d更換培養液1次。當細胞生長至覆蓋底面＞80%時，可進行消化傳代培養。經消化傳代后獲得較純成纖維樣滑膜細胞。鑒定包括光學相差顯微鏡下觀察細胞生長形態和流式細胞術檢測CD55陽性細胞率。本實驗使用第3～5代滑膜細胞。

3.2 siRNA轉染 轉染前24 h用不含抗生素的10%FBS培養基消化接種細胞培養板，以每孔2×105個細胞接種于6孔板，以每孔2×104個細胞接種于96孔培養板，使細胞融合度達50% ～80%時開始轉染。先用適量無血清培養基Opti-MEM I分別稀釋脂質體及siRNA，并輕輕混合，室溫孵育10～20 min。將siRNA-脂質體復合物加入細胞培養基中，輕輕前后搖動培養板混合，置于5%CO2、37℃培養箱中孵育5 h，予10%FBS培養基換液，后繼續培養箱中孵育 19、43 和 67 h。

3.3 熒光定量PCR法檢測RICTOR mRNA的表達轉染24 h后6孔板細胞每孔加入RNAiso Plus 1 mL，抽提細胞總RNA并溶于20 μL RNase-free H2O，取2 μL總RNA樣品于紫外分光光度計檢測A260/A280。按PrimeScript? RT reagent Kit試劑盒說明書進行反轉錄，反轉錄反應條件如下:37℃ 15 min，85℃ 5 s。反轉錄反應產物cDNA依照SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒說明書，行熒光定量 PCR反應。

RICTOR上游引物序列5'-GCTAGGTGCATTGACATACAACA-3'，下 游 引 物 序 列 5'-AGTGCTAGTTCA-CAGATAATGGC-3';GAPDH上游引物序列5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，下 游 引 物 序 列 5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'。反應體系總體積為 20 μL，含 cDNA 模板 1.8 μL，SYBR? Premix Ex TaqTM10 μL，上下游引物、ROX Reference Dye 各0.4 μL，ddH2O 7 μL。使用 ABI PRISM? 7000，設置反應程序:95℃ 30 s后，以95℃ 5 s，60℃ 31 s循環40次，95℃ 5 s，60℃ 31 s;反應結束后分析各樣本Ct值，并計算 2－ΔΔCt值。

3.4 Western blotting分析 RICTOR的蛋白表達轉染48 h、72 h后收集RA-FLS，用總蛋白提取試劑盒提取胞漿總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后，用Western blotting檢測其胞漿中RICTOR蛋白表達的變化，即取30 μL總蛋白，經8%SDS-PAGE電泳分離，電轉印到PVDF膜，封閉后加入Ⅰ抗(抗RICTOR 1∶500，抗 GAPDH 1∶5 000，取抗體稀釋液稀釋)，4 ℃搖床孵育過夜，加HRP標記Ⅱ抗(1∶5 000，取抗體稀釋液稀釋)孵育1 h，最后用增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)化學發光液，于暗室顯影后沖洗膠片。用Quantity One軟件進行分析，讀取吸光度(absorbance，A)及A×mm2值，計算各樣本中RICTOR與內參照GAPDH的吸光度值比較，以觀察特異性RICTOR siRNA轉染組與陰性對照組RICTOR蛋白表達量的變化。

3.5 四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法 實驗分4組:①無細胞組:僅加培養液;②空白對照組:加培養液與RA-FLS;③陰性對照組:RA-FLS轉染非特異性siRNA;④特異性RICTOR siRNA組:RA-FLS轉染特異性RICTOR siRNA。處理24 h、48 h、72 h后向96孔板每孔細胞加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37℃繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)液振蕩使結晶充分溶解。選擇490 nm波長，用酶聯免疫檢測儀測定各孔A值，記錄結果，計算各樣本與無細胞組A值的差值(ΔA)，比較轉染非特異性siRNA與特異性RICTOR siRNA后RA-FLS細胞活力(陰性對照或特異性RICTOR siRNA組ΔA/空白對照組ΔA)。

4 統計學處理

用SPSS 17.0軟件進行數據處理，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間差異比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 FLS培養的鑒定

光學顯微鏡下觀察可見細胞呈細長紡錘形，胞核邊界清楚，卵圓形，居中，核仁明顯，與成纖維細胞形似，鑒定細胞形態與FLS相符，見圖1。流式細胞術檢測培養的第3代細胞顯示CD55表達陽性率達96.8%，見圖2，提示所培養的細胞大部分為FLS。

Figure 1.Morphology of RA-FLS observed under optical microscope(×100).Cells were slender and fibroblastlike，while nuclei were clear，ovoid and center.圖1 鏡下觀察第3代RA-FLS形態

Figure 2.CD55 expression of passage 3 RA-FLS detected by flow cytometry.A:blank control;B:CD55 positive.CD55 expression in this case was 96.8%.圖2 流式細胞術檢測第3代RA-FLS CD55陽性細胞率結果

2 轉染siRNAs后對RA-FLS RICTOR mRNA表達的影響

熒光定量PCR技術檢測細胞內RICTOR mRNA表達，Ct值經過GAPDH標準化后，特異性RICTOR siRNA轉染24 h后，對mRNA干擾效率為(78.36±3.71)%，與陰性對照組比差異有統計學意義(P＜0.01)。

3 轉染siRNAs后對RA-FLS RICTOR蛋白表達的影響

Western blotting檢測結果顯示，轉染 RICTOR siRNA 48 h、72 h后，RICTOR蛋白表達較陰性對照組明顯下降，沉默效率分別為(92.48±6.14)%、(98.57 ±1.40)%(n=7，P ＜0.01)，見圖3。

Figure 3.Expression of RICTOR protein in cytoplasm examined by Western blotting after transfection of RICTOR siRNA［RICTOR(－)］for 48 h and 72 h.Compared with control group，the expression of RICTOR was significantly decreased in RICTOR siRNA group.圖3 轉染siRNA 48 h及72 h后RICTOR的蛋白表達

4 MTT法檢測轉染siRNA對RA-FLS活力的影響

轉染對RA-FLS活力呈時間依賴性，轉染24和48 h后，RICTOR siRNA轉染組與陰性對照組差異無統計學意義，但轉染72 h后，RICTOR siRNA組的細胞活力為(90.14±1.90)%，顯著低于陰性對照組(P＜0.01)，見表1。

表1 siRNA轉染不同時間后RA-FLS細胞存活力Table 1.The viability of RA-FLS after RICTOR siRNA transfection(%.Mean±SD.n=7)

討 論

mTOR存在于兩種多蛋白復合體—— mTORC1和mTORC2。mTORC1(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1)由mTOR、RAPTOR、mLST8和PRAS40組成，是PI3K/Akt/mTOR通路的重要組成，參與營養平衡、胰島素作用和細胞生存的調控。而mTORC2，即雷帕霉素不敏感復合體，由 RICTOR、mTOR、mSIN1和mLST8組成。其中，RICTOR是mTORC2的特異性成分，構成mTORC2的支架蛋白。尚有學者發現，用多等位基因打靶敲除的方法降低RICTOR在成纖維細胞中的表達后，可以導致成纖維細胞的增殖率下降，并降低了蛋白激酶Akt的活性和細胞的代謝能力［5］，提示 RICTOR還是 mTORC2發揮生物學作用必不可少的組成部分。目前認為，mTORC2主要作用機制是參與了Akt/PKB第473位絲氨酸磷酸化，而通過降低RICTOR蛋白表達可影響mTORC2功能的發揮和Akt的磷酸化［6］。

Akt又稱PKB，即蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過磷酸化一系列蛋白成分，抑制細胞凋亡，在細胞存活和凋亡中起重要作用。其在人惡性腫瘤中通常高度激活，Akt異常激活意味著腫瘤細胞對凋亡誘導的耐受、細胞增殖生長代謝的異常增加，是目前癌癥研究的重要靶標。已有研究發現，磷酸化的Akt及Akt酶活性在RA-FLS中表達升高，并可抑制 TNF-α引起的凋亡反應［7］;且Akt也參與了 TGF-β、fractalkine、lymphotoxin α 等細胞因子對RA-FLS促炎、增殖與抗凋亡的作用［8-10］。此外，Akt還被發現與RA軟骨破壞有關［11］，并在巨噬細胞介導的固有免疫中有著關鍵地位［12］。以上均提示Akt的磷酸化在RA發病機制中起著重要作用，而安全有效的Akt通路抑制劑將可能成為RA治療研究的新方向。

如今對mTORC2的研究是腫瘤領域的焦點，但其信號通路的功能仍尚待研究。已有學者發現，mTORC2參與了MMP-9活化并可通過PKC途徑影響細胞骨架參與神經膠質瘤細胞侵襲，并激活Akt通路促進細胞增殖，抑制凋亡［13］。另外，也有發現阻斷mTORC2通路，可促進多發性骨髓瘤、結腸癌腫瘤細胞凋亡、抑制增殖及轉移種植［14］;而該通路也被證實參與了乳腺癌細胞骨架變化，影響其趨化和轉移能力［15］。RA-FLS是滑膜中特殊的細胞群，RA發病后，其發生了腫瘤樣改變，表現為具有逃脫接觸抑制的能力，自主增殖程度增高，有侵襲的內在特性。mTORC2是否也參與了RA-FLS的生長異常，目前尚未有相關報道。

本課題利用siRNA介導的RNA干擾技術沉默RA-FLS中mTORC2的特異組成蛋白RICTOR的表達后，可顯著降低RA-FLS存活率，推測mTORC2可能參與了 RA-FLS的異常增殖或抗凋亡機制，為mTORC2信號通路在RA-FLS中作用機制的進一步研究提供線索。此外，實驗結果顯示，轉染24 h后，siRNA已開始影響mRNA翻譯，并在48 h后明顯抑制RICTOR蛋白表達。但RA-FLS細胞存活率在72 h后才出現顯著下降，考慮原因是:RICTOR的敲除并非直接抑制RA-FLS生長，它通過減少mTORC2復合物形成，影響下游信號轉導通路，從而引起細胞凋亡或增殖減少，這可能與其抑制Akt磷酸化有關，但其下游通路仍有待進一步實驗探索及證實。本實驗通過沉默mTORC2可抑制RA-FLS生長的發現，為RA發病機制的研究和治療提供了新思路。

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