單核細胞增生性李斯特菌生物被膜形成調控機制研究進展

張 輝，崔煥忠，鄭 鑫

（吉林農業大學動物科技學院，吉林 長春130118）

單核細胞增生性李斯特菌（Listeriamonocytogenes，LM）是重要的人獸共患食源性病原菌，可引起人、多種動物感染發病，病死率高達20%～30%。近年來，李斯特菌病在世界范圍內都有發生，并且發病具有上升趨勢。由于該菌在自然界中廣泛存在，并可形成生物被膜，增強了該菌對外界環境的抵抗力。李斯特菌病的發生80%是由生物被膜引起，由于生物被膜的多重耐藥性，給臨床治療帶來巨大困難［1］，嚴重的危害了人們健康，影響畜牧業發展。深入了解生物被膜形成調控機制，將有助于尋找生物被膜形成的抑制劑，降低人和動物感染發病的幾率［2］。

生物被膜（biofilm，簡稱BF）的概念最初是由加拿大微生物學家J.William Costerton提出來的，是指細菌粘附于接觸表面，分泌胞外多聚物，將自身包繞而形成的微生物群落。細菌生物被膜形成及成熟過程涉及復雜的細胞間信號轉導機制，目前證實有3種信號分子參與機制的調節。革蘭陰性菌具有酰基高絲氨酸內酯自身誘導劑，革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有自身誘導劑2（Autoinducer－2，AI－2），AI－2是惟一一個在革蘭陽性菌與陰性菌中同時存在的群感效應系統，而革蘭陽性菌則利用縮氨酸介導的信號通路進行信號調節［3］。

1 正向調控機制

1.1 轉錄調節子PrfA對生物被膜形成的調控PrfA是正向調控生物被膜形成的因子之一。研究發現與野生型菌株EGD相比，PrfA基因突變菌株（ΔPrfA）形成生物被膜的能力明顯降低，倒置顯微鏡下觀察到EGD株能形成致密的鏈網狀膜結構，交聯度較高，而ΔPrfA株形成的鏈網狀膜結構相對比較疏松，交聯度稍低。統計分析表明，EGD株與無害李斯特菌之間形成生物被膜的差異顯著。而無害李斯特菌幾乎沒有成型的鏈網狀膜結構形成，暗示生物被膜的形成可能與LM的致病性有關［4］。

PrfA蛋白是轉錄調節子CRP－FNR家族的成員之一，小分子輔助因子調控許多家族成員蛋白的活性狀態［5］。利用點突變構建兩個基因突變菌株，研究其對生物被膜形成的影響。在基因突變菌株prfA＊中，變異PrfA蛋白的功能被限定在細胞內活力狀態，即在宿主細胞漿內能夠持續表達毒力因子ActA蛋白，并可通過激活PplcA，增加PrfA蛋白的表達；而在基因突變菌株PrfA（Y154C）中，變異的PrfA蛋白不能完全轉變為胞內活力狀態，即在胞內感染階段不能正向調控ActA蛋白表達，雖然可以進入宿主細胞漿但是不能完成細胞間的擴散。prfA＊在室溫和30℃下形成的生物被膜量與野生型相同，但是在36℃下比野生型要少。PrfA（Y154C）在30℃和36℃下形成生物被膜的量均增加，但是在室溫下與野生型菌相同。不能完全轉變為胞內活力狀態的突變菌株有利于生物被膜的形成，生物被膜形成能力的增加可能是由于PrfA蛋白變構調節的結果［4］。

1.2 DegU LM具有17個編碼二組分系統的基因簇，枯草桿菌DegS/DegU系統在控制細菌靜止期適應性反應方面起著重要作用［6］。研究表明LM不存在DegS激酶的同源基因，但具有DegU（降解酶調節因子）反應調節同系物，DegU作為孤立的反應調節器，在調控細菌一些重要的適應性反應方面發揮著重要的作用［7］。滅活DegU基因表明，DegU通過直接與DegU基因啟動子區結合，從而負調控自身合成。DegU基因與其下游的yviA基因共轉錄。DegU為LM鞭毛合成及細菌運動性所必需，也是細菌在高溫條件下生長，粘附到塑料表面并有效形成生物被膜所需要的因子［8］。

1.3 Agr操縱子 Agr操縱子可以調控毒力因子的表達，并與生物被膜的形成相關。Agr操縱子為LM的群感效應系統，正向調控生物被膜的形成［9］。Agr操縱子包括agrB、agrD、agrC和agrA四個因子，Aurélie等分別構建了agrA和agrD框內缺失菌株，研究了Agr操縱子對生物被膜形成的影響，結果表明，基因缺失菌株ΔagrA和ΔagrD對玻璃片的粘附能力均顯著降低，表明Agr操縱子參與生物被膜形成的粘附過程。在生物被膜形成的早期，突變體ΔagrA和ΔagrD在聚苯乙烯上形成生物被膜的能力明顯低于親本菌株［10］。agrA和agrD雙基因缺失菌株對靜止或動態培養LM生物被膜的形成都有影響。Agr操縱子可以直接調控生物被膜形成，還可通過調控LM毒力因子的表達間接調生物被膜形成［11］。

1.4 其他正向調控因子 壓力調控因子sigma B與LM生物被膜的形成有關，張強等比較了EGD、基因缺失菌株Δsigma B以及無害李斯特菌生物被膜的形成能力，結果表明3種菌株形成生物被膜的能力具有一定的差異，暗示sigma B對生物被膜的形成具有一定的影響［12］。

LM的胞外DNA是細菌最初粘附和生物被膜形成的必要物質，胞外DNA通過某種特定的方式與肽聚糖的N－乙酰葡萄糖氨相互作用，參與生物被膜形成的粘附過程，這種粘附過程需要高分子質量的DNA參與，而且細菌表面的粘附位點可以被DNA 飽和［13］。

LM需要借助鞭毛的趨化運動使浮游的細菌向有營養物質的表面游動，并克服表面張力到達并粘附到物體表面，使粘附的細菌個體從載體表面播散出去，與細菌的胞外基質相互作用，在生物被膜中起橋梁作用，形成穩定生物被膜結構［14－15］。

2 負向分子調控機制

2.1 ABC轉輸通透酶對生物被膜形成的調控Zhu等采用轉座子誘變構建基因缺失菌株，該基因缺失菌株Δ1771形成生物被膜能力增強，lm.G_1771基因可能編碼ABC轉運通透酶，表明ABC轉輸通透酶負調控生物被膜的形成［16］。轉錄組學研究表明，lm.G_1771基因通過調節編碼Dlt表面蛋白、細胞表面錨定蛋白SrtA以及轉錄調節子GntR等參與生物被膜形成的候選基因來調控生物被膜的形成。基因缺失菌株Δ1771對曲拉通－100敏感性和陽離子抗生素增加。dlt基因參與將丙氨酸殘基合并為脂磷壁酸過程，由于基因缺失菌株Δ1771中Dlt操縱子基因的下調，導致磷壁酸表面帶正電荷，使突變菌株對陽離子抗生素的抵抗力降低［17］。通過同源重組獲得的回復體形成生物被膜的量與野生型菌株相同。

2.2 luxS對生物被膜形成的調控luxS基因編碼S－核糖基高半胱氨酸酶，該酶可將S－核糖基高半胱氨酸（S－ribosyl homocysteine，SRH）催化水解為高半胱氨酸和4，5－二羥基－2，3－戊二酮（DPD），DPD經過化學修飾形成自身誘導物－2（AI－2），AI－2是細菌種間信息傳遞的因子。luxS參與多種致病菌生物被膜的形成［18］。研究發現，luxS基因缺失菌株的粘附能力比親本菌株高19倍，并且形成生物被膜的量也相應增加。但是外源的AI－2不能使突變菌株恢復野生型表型，推斷luxS基因可能通過三維復合構造參與抑制細胞粘附及生物被膜的形成過程，這一調控機制與可能 AI－2無關。Challan等［19］通過比較luxS基因缺失菌株與EDG株之間的浮游生長、浮游運動性、磷脂酶活性、溶血活性以及生物被膜形成的差異，研究luxS對生物被膜形成的調控，結果發現，連續培養48h，luxS基因缺失菌株形成生物被膜的密度比野生型菌株EDG高17倍，并且在細菌培養上清液中S－腺苷高半胱氨酸（S－adenosyl homocysteine，SAH）和SRH的含量均高于親本菌株，并證實了生物被膜的形成與AI－2和SAH無關，而是通過SRH調節粘附細胞的數量，調控生物被膜的形成，但是其確切調控機制尚不清楚。

3 理化因素對生物被膜形成的影響

生物被膜的形成受營養條件、溫度、生長環境及粘附材料種類等因素的影響［20］。Begley等［21］發現，在膽汁的存在下，細菌通過調整多種代謝途徑來加快其生長速度，增強生物被膜的形成能力。劉彤等［22］研究了溫度對生物被膜形成的影響，結果表明，隨著培養溫度下降生物被膜形成顯著減少。添加適量的葡萄糖可以提高形成生物被膜的能力，表明富含營養的環境有利于LM形成生物被膜［23］。低濃度的NaCl（低于0.5%）可促進生物被膜的形成，高濃度NaCl則會抑制生物被膜的形成。

4 問題與展望

生物被膜的形成受調控因子的調控，目前對LM生物被膜形成相關調控因子的研究，主要是發現未知的與生物被膜形成相關的基因以及驗證一些已知功能基因在其生物被膜形成中的作用［24］。而有關調控生物被膜形成的確切分子機制以及生物被膜分子間信號的轉導等方面的研究還不是非常深入，因此今后研究方向應集中于生物膜形成分子調節機制、相關基因之間的表達調控，以及一些控制技術領域。詳細了解生物被膜形成的機制，對于尋找生物被膜形成抑制劑，以及有效地控制生物被膜的形成具有重要意義。

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