超微粉中藥對(duì)人工感染雞毒支原體病雞的治療試驗(yàn)

孟冬霞，賀東昌，武果桃，韓一超，姚敬明，任 杰，趙 娟，張偉業(yè)，孟 帆，孫建鋼

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原030032）

雞毒支原體（MG）感染常稱之為雞慢性呼吸道病（CRD），是家禽致病性最強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)損失最大的支原體病［1］。本病廣泛分布于世界各國(guó)，在我國(guó)的感染率也很高，部分地區(qū)可達(dá)75%以上［2］。為尋求高效、低毒、無殘留、無污染、綠色抗CRD的中藥，根據(jù)中醫(yī)學(xué)扶正祛邪的治療原則和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)整合調(diào)控的理論，結(jié)合本病的特點(diǎn)選擇黃芪、當(dāng)歸、明黨參、麻黃、杏仁、陳皮、茯苓、金銀花、穿心蓮、魚腥草及甘草等中藥組成組方Ⅰ（暫名復(fù)方參麻散，簡(jiǎn)稱FSMS），選用石決明、草決明、黃芩、魚腥草、黃芪、甘草等中藥組成組方Ⅱ（暫名復(fù)方明草散，簡(jiǎn)稱FMCS），均進(jìn)行超微粉碎，粒度達(dá)300目以上，在體外抑菌試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行了FSMS、FMCS的體內(nèi)藥效學(xué)研究，觀察其對(duì)雞毒支原體感染的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 受試中藥FSMS及FMCS均由本實(shí)驗(yàn)室組方，方中的黃芪、麻黃、杏仁及黃芩、魚腥草等中藥，購自河北安國(guó)市祁瑞中藥材有限責(zé)任公司，并由其進(jìn)行超微粉碎，粉碎粒度達(dá)300目以上。將微粉制劑用蒸餾水浸泡2h，武火煮沸后文火維持30min，3 000r/min離心10min，除去藥渣，加熱濃縮至每毫升相當(dāng)于生藥3g，4℃保存?zhèn)溆谩?duì)照藥物酒石酸泰樂菌素可溶性粉，山東魯抗動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1001015，每毫克含泰樂菌素1 000單位。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株及診斷試劑 雞毒支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株S6株、雞毒支原體血清平板凝集抗原及標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽性血清，購自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.1.3 疫苗 雞新城疫Ⅰ系疫苗，哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：2010105。

1.1.4 主要試劑 支原體肉湯培養(yǎng)基、葡萄糖、L－半胱氨酸鹽酸鹽、小牛血清及瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），Genview公司產(chǎn)品。醋酸鉈，Sigma公司產(chǎn)品。青霉素，石家莊制藥廠產(chǎn)品。氫氧化鈉、酚紅為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.5 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱，型號(hào)：MCO－17AI，日本三洋公司；超微粉碎機(jī)，型號(hào)：BMF－10型，濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司。

1.1.6 試驗(yàn)動(dòng)物 無母源抗體的560只1日齡海藍(lán)褐蛋雞，購自山西××有限公司，未經(jīng)MG疫苗免疫，在潔凈動(dòng)物舍內(nèi)隔離飼養(yǎng)，飼喂至16日齡，經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)MG抗體陰性，取20只用于臨床藥物安全性試驗(yàn)，剩余540只用于雞毒支原體感染的防治試驗(yàn)，每組60只雞。

1.2 方法

1.2.1 改良Frey氏培養(yǎng)基的配制 參照文獻(xiàn)［1］配制，并調(diào)整pH值至7.6，過濾除菌，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 臨床用藥安全性試驗(yàn) 超微粉中藥按1%（即推薦治療劑量的10倍）添加于水中，供7日齡雛雞飲用，每個(gè)配方10只雞，1d2次，連用15d，每天觀察并記錄其臨床癥狀，15d后，每組任選5只剖檢觀察病理變化。

1.2.3 雞毒支原體感染病理模型復(fù)制 用109ccu/mL MG培養(yǎng)物接種健康 MG陰性雞，每只雞滴鼻0.3mL、點(diǎn)眼0.2mL，氣囊接種0.5mL；攻毒后第5天用雞新城疫Ⅰ疫苗激發(fā)（5頭份/只，含有雞新城疫病毒105.0ELD50/頭份，噴霧）。感染后第10天每組抽15只雞采血作血清快速平板凝集試驗(yàn)，做進(jìn)一步確診。同時(shí)，各組隨機(jī)剖檢2～4只雞，觀察氣囊病變。

1.2.4 雞毒支原體的分離鑒定及生物學(xué)觀察方法參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行。

1.2.5 試驗(yàn)分組及藥物使用方法 將試驗(yàn)雞隨機(jī)分為西藥對(duì)照組，于攻毒出現(xiàn)癥狀后按常規(guī)投藥，每1升水加500mg酒石酸泰樂菌素可溶性粉，混飲，連用3～5d；超微粉中藥治療組于攻毒出現(xiàn)癥狀后添加試驗(yàn)藥液，高、中、低劑量組分別按0.2%、0.1%、0.05%（即每只雞每天用藥量分別為：0.6g、0.3g、0.15g）混飲，每日2次，連續(xù)7d；藥液每天配換1次，停藥后觀察21d。攻毒對(duì)照組，接種MG菌液；空白對(duì)照組，接種滅菌生理鹽水。

1.2.6 考核指標(biāo) 根據(jù)治愈率、增重及氣囊病理損傷計(jì)分全面考核組方的治療效果。氣囊病理損傷計(jì)分參照Yoder［4］計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)，分為5級(jí)。

雞平均氣囊病理損傷度（計(jì)分）＝所有雞氣囊損傷度總和/被檢雞數(shù)。

氣囊損傷減少率＝（感染對(duì)照組每只雞氣囊損傷平均分－試驗(yàn)組每只雞氣囊損傷平均分）/感染對(duì)照組每只雞氣囊損傷平均分。

1.2.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 治愈率及氣囊損傷減少率用t檢驗(yàn)法、平均增重用SPSS 17.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床用藥安全性試驗(yàn) 試驗(yàn)期間，兩個(gè)組方雞精神、飲食、糞便等均未見明顯異常。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組隨機(jī)剖檢5只雞，心、肝、脾、肺、腎等臟器均無肉眼可見變化。表明：兩個(gè)組方均對(duì)雞安全。

2.2 雞毒支原體感染病理模型復(fù)制 攻毒后4d，個(gè)別雞有鼻液，大部分試驗(yàn)雞未出現(xiàn)明顯臨床癥狀；激發(fā)接種后3～5d，除空白對(duì)照組外，其余各組均出現(xiàn)數(shù)量不等、程度不同的精神沉郁、漿液或黏液性鼻液、甩頭、噴嚏、咳嗽及呼吸道啰音。感染后第10天，各組隨機(jī)剖檢2～4只，發(fā)病雞均可見氣囊增厚、渾濁、布滿大量黃白色干酪樣滲出物，部分雞喉頭、氣管積有黏液、氣管黏膜充血、出血變化；血清平板凝集試驗(yàn)結(jié)果呈陽性；從感染雞的喉頭、氣管中分離出微生物，對(duì)病原分離物進(jìn)行純化、涂片、瑞氏染色，油鏡觀察可見典型的球形菌體；在改良Frey培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5代，再接種到固體培養(yǎng)基上，可見典型的“煎蛋樣”菌落；用Diense染色法染色，菌落邊緣呈淡藍(lán)色，中央隆起部呈深藍(lán)色，且在30min內(nèi)不退色，可以排除L型細(xì)菌；低倍鏡下可見菌落周圍吸附了大量的紅細(xì)胞。根據(jù)臨床癥狀、病理變化、血清學(xué)檢查和病原分離鑒定綜合診斷，MG感染成功。

2.3 臨床試驗(yàn)結(jié)果 治療試驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1中可以看出：FSMS高劑量治療組治愈率最高，與中劑量FSMS治療組及西藥對(duì)照組的治愈率差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他各組（P＜0.05）；FSMS高劑量治療組平均增重與FSMS中劑量治療組、西藥對(duì)照組及空白對(duì)照組間差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于FSMS低劑量治療組（P＜0.05），極顯著高于其他各組（P＜0.01）。

2.4 氣囊損傷情況 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組的氣囊病理損傷度及氣囊病理損傷減少率結(jié)果見表2。

表1 治愈率及平均增重試驗(yàn)

表2 氣囊病理損傷試驗(yàn)

由表2中可以看出，F(xiàn)SMS高劑量治療組與FSMS中劑量治療組間平均氣囊病理損傷度及氣囊損傷減少率差異不顯著（P＞0.05），與西藥對(duì)照組間差異顯著（P＜0.05），與其他各組間差異極顯著（P＜0.01）。攻毒對(duì)照組的平均氣囊病理損傷度極顯著高于其他各組（P＜0.01）。

根據(jù)治愈率、平均增重、氣囊病理損傷度及氣囊損傷減少率等指標(biāo)綜合分析，確定配方為FSMS，治療劑量為0.1%。

3 討論與小結(jié)

3.1 通過超微粉中藥對(duì)雞毒支原體感染的藥效學(xué)試驗(yàn)可以看出，所選的兩個(gè)組方對(duì)雞毒支原體感染均有一定的治療、增重及減輕氣囊損傷作用，但FSMS的效果優(yōu)于FMCS，且FSMS高、中劑量間差異不顯著，考慮到實(shí)際養(yǎng)殖中用藥成本的問題，建議以中劑量為宜。治療時(shí)，試驗(yàn)藥液（3g/mL）按0.1%濃度混飲，連用7d。

3.2 根據(jù)中醫(yī)理論分析，急病多實(shí)，慢病多虛，同時(shí)MG又多以環(huán)境惡化、飼養(yǎng)管理不良、寒冷、機(jī)體抵抗力下降，正氣受損為誘因，據(jù)此本病應(yīng)屬虛證范疇，但根據(jù)病理變化，肺組織的肉變、硬變、壞死及咳喘等癥狀，又是邪實(shí)的表現(xiàn)。故綜合上述分析，本癥屬正虛邪實(shí)，故治則應(yīng)扶正祛邪，以補(bǔ)肺潤(rùn)肺以扶正，宣肺平喘、理氣化痰、清熱解毒以祛邪。復(fù)方參麻散（FSMS）方中黃芪、當(dāng)歸補(bǔ)養(yǎng)氣血、提高免疫功能、活血行血，明黨參補(bǔ)氣生津、潤(rùn)肺化痰，為主藥；麻黃、杏仁等宣肺平喘為輔藥；陳皮、茯苓等理氣化痰、止咳。金銀花、穿心蓮、魚腥草等清熱解毒，清肺利咽共為佐藥。甘草調(diào)和諸藥，并能補(bǔ)中益氣，止咳化痰為使藥。諸藥合用可止咳平喘，理氣化痰、清熱解毒。

［1］ 〔美〕Saif Y M.禽病學(xué)［M］.蘇敬良，高福，索勛，譯.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005：818－867.

［2］ 牟建青，艾武，張秀美，等.雞毒支原體感染的診斷與防治研究進(jìn)展［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，4：54－55.

［3］ 王春元，韋旭斌，王魯，等.中藥果根素對(duì)人工感染雞毒支原體病雞的治療試驗(yàn)［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29（8）：1062－1084.

［4］ Yoder H W .Laboratory A mannual of the isolation and identification of avian pathogens［M］.3rd ed.New York：American Association of Avian Pathologist，1989：57－62.