48例傳染性單核細胞增多癥患兒EB病毒核酸定量和異型淋巴細胞的實驗室臨床意義

陳德林 潘麗

48例傳染性單核細胞增多癥患兒EB病毒核酸定量和異型淋巴細胞的實驗室臨床意義

陳德林 潘麗

目的研究傳染性單核細胞增多癥(以下簡稱傳單)患兒實驗室檢測中EB病毒DNA和異型淋巴細胞的輔助診斷的臨床意義。方法采取實時熒光PCR技術(shù)來定量檢測EB病毒DNA的含量拷貝數(shù)(＞1.0×103為陽性)和血液室異型淋巴細胞計數(shù)檢測比例(＞4%為陽性)。結(jié)果在48例傳單患者中，EB病毒DNA＞1.0×103(陽性)40例，EB病毒DNA＜1.0×103(陰性)8例。異型淋巴細胞＞4%(陽性)22例，異型淋巴細胞＜4%(陰性)26例。EB病毒DNA陽性率占83.3%;異型淋巴細胞陽性率占45.8%。說明實驗室檢測對傳單患兒有較高的輔助診斷價值。結(jié)論EB病毒DNA定量拷貝數(shù)檢測有相當高的診斷價值，為臨床提供傳單患者的快速診斷;異型淋巴細胞檢測具有45.8%陽性輔助診斷價值，雖然輔助診斷價值沒有核酸檢測高，但是對實驗室條件要求不高，更適合不具備條件開展分子生物實驗室的基層醫(yī)院開展輔助診斷傳單患者。

傳單患者;EB病毒DNA;異型淋巴細胞;相關(guān)性

皰疹病毒是一較大的囊膜的雙鏈DNA病毒，分為A群和B群兩個亞群。凡在體外培養(yǎng)時，容易從細胞內(nèi)釋放營養(yǎng)液中的病毒為A群;病毒同細胞緊密結(jié)合，很難釋放到營養(yǎng)液中的為B群。基因組結(jié)構(gòu)由末端重復序列和內(nèi)部重復序列組成，皰疹病毒基因可以整合于細胞的基因內(nèi)，成為細胞DNA的一部分，形成長期潛伏感染狀態(tài)，皰疹病毒潛伏感染與腫瘤發(fā)生有關(guān)，尤其與鼻咽癌密切相關(guān)，EB病毒屬皰疹病毒4型，EB病毒感染可引起傳染性單核細胞增多癥、鼻咽癌、兒童淋巴瘤。傳染性單核細胞增多癥是我國常見的幼兒傳染病，人群普遍易感，是由EB病毒引起的急性傳染病，EB病毒是一種嗜淋巴細胞病毒，70%淋巴細胞細胞增多，而且異型淋巴細胞明顯增多［1］，傳單患者大部分鼻咽部含有EB病毒。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有標本均來自本院確診的病房患者和部分門診患者，由護理人員抽取患者靜脈血2～3 ml注入EDTA-K2抗凝管中送檢，用水平離心機1500r/min離心10 min編號待測。男性30人，女性18人;年齡最小6月，最大13歲，平均年齡4.1歲，且均為臨床上最后確診為傳染性單核細胞增多癥48例，其中EB病毒DNA定量拷貝數(shù)＞1.0×103(陽性)40例，異淋巴細胞＞4%(陽性)22例。

1.2 異淋巴細胞檢測儀器、試劑及方法 異型淋巴細胞檢測EDTA-K2抗凝全血用SYSMEX-2100血流流水線上自動推片機進行推片，自動瑞士染液染色的血片，由經(jīng)驗豐富的血液工作人員兩人共閱片求出的均值作為最后異型淋巴細胞計數(shù)值(＞4%為陽性)。

1.3 EB病毒DNA定量檢測儀器、試劑及方法 使用羅氏(LightCycler?480)480PCR擴增分析儀，采用中山大學達安基因試劑盒進行定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測，方法為實時熒光PCR技術(shù)進行定量檢測。質(zhì)量控制:查看陰性，陽性及標準定值是否吻合決定此次檢測情況。陰性質(zhì)控品:增長曲線不呈“3”型曲線或Ct=30，陽性質(zhì)控品:增長曲線呈“3”型線，且強陽性質(zhì)控品定量參值在1.0×106～2.0×108范圍，臨界陽性質(zhì)控品參考值在2.0×102～2.0×104IU/ml范圍(參考值為儀器自動分析計算出的數(shù)值)。陽性定量參考品:全部陽性，且線性相關(guān)系數(shù)0.97≤∣r∣≤1。測定結(jié)果有效必須具備以上質(zhì)控條件同時滿足，否則結(jié)果無效，需重做實驗。檢測EB病毒DNA靈敏檢測范圍在102～107拷貝/ml之間。

1.4 操作步驟

1.4.1 異型淋巴細胞檢測EDTA-K2抗凝全血充分混勻20次后，用SYSMEX-2100血液流水線上自動推片機進行推片，自動瑞氏染液染色的血片，由經(jīng)驗豐富的血液工作人員兩人共閱血片的體尾部細胞分布均勻的部位，求出的均值作為最后異型淋巴細胞計數(shù)值(＞4%為陽性)。

1.4.2 EB病毒DNA的定量測定

1.4.2.1 DNA提取(標本處理區(qū)) ①取1.5 ml滅菌離心管編號(與標本同號)。②取50 μl DNA提取液于1.5 ml滅菌離心管中，細心提取血清與血細胞交界處的白細胞層，盡量吸完放入滅菌離心管中，充分吹打混勻約靜置5 min。③振蕩器劇烈振蕩混勻5～10 s，置(100±1)℃恒溫金屬浴中孵育(10±1)min，12000r/min離心5 min備用。

1.4.2.2 試劑準備(試劑準備區(qū)) ①從冰箱中取出EB病毒DNA檢測試劑，室溫解凍，取0.2 ml樣品擴增八連管，按比例加入EB病毒DNA-PCR反應(yīng)液40 μl+Taq酶3 μl/人份至八連管中。②將加好試劑的擴增八連管放入試劑準備區(qū)和標本處理區(qū)之間的傳遞窗中。③加樣:在標本處理區(qū)從傳遞窗中取出加好試劑的八連管于生物安全柜中加樣，分別依次加入處理好的標本上清液2 μl，陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品和強陽性質(zhì)控品后，蓋上密封條密閉，8000 r/min離心數(shù)秒。④將處理好的樣本放入標本處理區(qū)和擴增區(qū)之間的傳遞窗中，準備擴增。

1.4.2.3 樣品擴增(PCR擴增區(qū)) ①打開擴增區(qū)電腦及LightCycler?480主機，查看反應(yīng)條件是否吻合，否則重新設(shè)置。②從傳遞窗中取出準備好的樣品擴增管，放入LightCycler?480主機儀器擴增板內(nèi)，再放進LightCycler?480主機進行擴增。

2 結(jié)果

2.1 異型淋巴細胞＞4%(陽性組)的22例，EB病毒DNA檢測值＞1.0×103(陽性組)標本40例，見表1。

2.2 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在臨床確診的傳染性單核細胞增多癥48例患者中，EB病毒DNA定量核酸檢測陽性達83.3%，由于核酸檢測速度快，使用EDTA-K2抗凝全血采樣方便，對傳染性單核細胞增多癥患者有非常高的早期診斷價值，EDTA-K2抗凝全血涂片查異型淋巴細胞對傳染性單核細胞增多癥診斷陽性率也高達45.8%(高于文獻2所述［2］)，此次研究發(fā)現(xiàn)EB病毒DNA定量核酸檢測明顯高于血涂片查異型淋巴細胞對傳染性單核細胞增多癥，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 統(tǒng)計方法處理 t檢驗。

表1 EB病毒核酸定量和異型淋巴細胞相關(guān)性比較［例數(shù)(%)］

3 討論

】EB病毒感染引起的傳染病，人員普遍易感，EB病毒(EBV)幾乎與所有鼻咽癌有關(guān);EB病毒(EBV)對診斷傳染性單核細胞增多癥至關(guān)重要;EB病毒(EBV)還同Burkitt淋巴瘤、免疫損傷性患者的淋巴瘤有關(guān);EB病毒(EBV)同時也可能與何杰金氏病(Hodgkinsdisease)、慢性疲勞綜合征、移植后淋巴組織增生癥等有關(guān);檢測 EBV病毒的PCR(EBVDNA)，PCR熒光定量技術(shù)可從少量標本中擴增檢測出所需DNA，適用于多種不同標本的檢測。為臨床檢測、普查EBV提供快速、準確的檢測手段。

本次檢測的均為臨床確診的傳染性單核細胞增多癥患者，傳染性單核細胞增多癥是由EB病毒感染引起的傳染病，人員普遍易感。EB病毒(EBV)核酸檢測對診斷傳染性單核細胞增多癥至關(guān)重要，本次是EDTA-K2抗凝全血提白細胞層檢測核酸檢測，陽性率高達83.3%高于文獻3中所述［3］，而且具有采樣方便，檢測時間快;可能陽性率更高，非常高的早期診斷價值診斷價值。此次實驗檢測沒有取鼻咽部分泌物進行核酸檢測，傳染性單核細胞增多癥患者大部分鼻咽部含有EB病毒，采樣更方便，可能陽性率更高。

EB病毒是一種嗜淋巴細胞病毒，70%傳染性單核細胞增多癥患者淋巴細胞細胞增多，而且異型淋巴細胞也明顯增多，可見異型淋巴細胞也是實驗室輔助診斷傳染性單核細胞增多癥的重要方法，陽性率45.8%高于文獻4中所述［4］。雖然不如核酸檢測陽性率的臨床意義大。但是對實驗環(huán)境要求不高，適合于各級實驗室，更適合于不具備條件開展PCR核酸檢測的醫(yī)院輔助診斷傳染性單核細胞增多癥。

［1］ 陳尚明，黃海英.小兒傳染性單核細胞增多癥72例臨床分析.南通醫(yī)學院學報，2009，29(4):305 －307.

［2］ 陸丹，胡興文，曾菊.兒童EB病毒感染與異型淋巴細胞相關(guān)性分析，中國實驗診斷學，2009，13(12):1732 －1734.

［3］ 于謹銘，羅兵，李詠梅，等.EBV-DNA檢測在兒童EB病毒感染中的臨床意義.醫(yī)學檢驗與臨床，2012，23(5):8－10.

［4］ 劉瑩，曹軍皓，容東寧，等.傳染性單核細胞增多癥.異型淋巴細胞數(shù)量與EB病毒濃度的關(guān)系.實驗醫(yī)學雜志，2008，24(20):3582－3583.

563000 遵義市第一人民醫(yī)院檢驗科