二甲雙胍調節內皮細胞組織因子途徑抑制物的表達

侯英健，史小琴，韓艷梅，李 惠，郭昊天

(河北大學基礎醫學院，河北保定 071000)

組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)高表達于血管內皮細胞表面，特異性抑制外源性凝血途徑，是一種控制凝血啟動的抗凝蛋白［1］。血栓形成是糖尿病的主要并發癥之一。糖尿病患者血糖持續升高，導致糖基化終末產物(advanced glycosylation end products，AGEs)的生成［2］。AGEs水平可上調組織因子，促進血栓形成。作為控制糖尿病的一線用藥，二甲雙胍明顯緩解糖尿病并發癥［3］，但目前尚無其調節糖尿病血栓及TFPI表達的報道。本研究檢測了二甲雙胍對TFPI表達的影響，并初步探討了其中機制，為糖尿病血栓的干預提供了新的靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑 二甲雙胍(美國Sigma公司)，兔抗人 β-actin多克隆抗體及小鼠抗人TFPI單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內皮細胞的培養 從人臍靜脈中分離原代內皮細胞，種植于鋪有鼠尾膠原的培養皿中，用含10% 胎牛血清的M199培養基常規培養。

1.2.2 糖基化牛血清白蛋白的制備 將牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖溶磷酸緩沖液中(pH 7.4)，過濾除菌后在37℃下孵育3個月。

1.2.3 熒光實時定量PCR檢測TFPI mRNA的表達 提取細胞總RNA，并反轉錄為cDNA。用MxPro QPCR系統進行定量PCR檢測。β-actin作為內參照。

1.2.4 Western blot方法檢測蛋白表達 提取蛋白質，進行SDS-PAGE電泳，轉膜封閉后，加入適當濃度的第一抗體(室溫孵育4 h)和第二抗體(室溫孵育1 h)后，進行化學發光(ECL)顯色。

2 結果

2.1 二甲雙胍上調內皮細胞TFPI mRNA水平 AGEs(50 mg·L-1)明顯下調內皮細胞TFPI mRNA表達(P＜0.01)。在AGEs刺激內皮細胞的同時，給予二甲雙胍。結果表明，1 μmol·L-1的二甲雙胍對TFPI的表達無明顯調節作用，而5與10 μmol·L-1的二甲雙胍均明顯逆轉AGEs對TFPI的抑制作用(P＜0.05)。

2.2 二甲雙胍上調內皮細胞TFPI蛋白表達水平 AGEs(50 mg·L-1)明顯下調內皮細胞TFPI蛋白表達，而二甲雙胍(5 μmol·L-1)明顯逆轉AGEs對TFPI的抑制作用。

3 討論

二甲雙胍不僅能夠有效控制血糖，還明顯抑制糖尿病血管并發癥。王景尚等［4］研究表明，其機制可能為二甲雙胍降低了血漿中 AGEs的水平。但是本課題組發現，即使在AGEs含量不發生改變時，二甲雙胍仍能夠通過調節其下游通路發揮抗凝作用。我們以AGEs刺激血管內皮細胞，同時給予二甲雙胍處理。檢測后發現，二甲雙胍部分阻斷了AGEs對TFPI表達的抑制作用。本課題組之前研究表明，AMPK上調TFPI表達，進而發揮抗血栓的作用［5］，而二甲雙胍激活AMPK的作用已得到廣泛證實。因此我們推斷AMPK信號通路參與了二甲雙胍對TFPI的上調作用。

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［5］侯英健，韓艷梅，史小琴，等.瑞舒伐他汀對內皮細胞中組織因子途徑抑制物表達的影響［J］.中國藥理學通報，2012，28(8):1146-9.

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