內質網應激與腦缺血/再灌注損傷

武彩霞，劉 睿，杜冠華

(1.中國醫學科學院藥物研究所國家藥物篩選中心北京 100050;2.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院 沈陽 110016;3.山東醫學高等專科學校臨沂 276002)

腦缺血/再灌注損傷是在腦缺血基礎上再灌注導致的腦組織進一步損傷，最終會導致神經細胞壞死或凋亡。凋亡的細胞主要為神經元，部分為神經膠質細胞和血管內皮細胞，其發生機制尚未完全清楚。關于細胞凋亡，內質網應激啟動的凋亡途徑，是除了死亡受體途徑、線粒體途徑外，目前較受關注的一種新的誘發凋亡途徑［1］。有資料顯示，缺血預適應(ischemic preconditioning，IPC)可以減輕缺血/再灌注造成的組織損傷，其機制與缺血預適應能減弱內質網應激密切相關［2，3］。另外，還有人認為，內質網應激在腦缺血/再灌注損傷的過程中，處于中心地位［4］。可見內質網應激是導致腦缺血/再灌注損傷的重要原因。本文對近年來內質網應激與腦缺血/再灌注損傷的關系進行綜述，以期為腦卒中的理論及臨床研究提供依據，并為治療腦卒中的藥物發現提供新思路。

1 內質網功能及內質網應激的機制

內質網和高爾基體是真核細胞內多數蛋白質合成、加工和轉運的場所。蛋白質在內質網內完成轉錄、翻譯過程，并經糖基化、折疊或裝配成多亞基的聚合物，最終形成具有天然構象的蛋白質。然后由內質網運輸到高爾基體，被進一步修飾，經高爾基體小泡運輸到目的地。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指缺血缺氧、葡萄糖或營養物質缺乏、脂質過度負荷、病毒感染、藥物、毒素等有害因素破壞內質網的穩態，出現錯誤折疊與未折疊蛋白在腔內聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態。可分為3種類型［5］:(1)未折疊蛋白質反應(unfolded protein response，UPR);(2)內質網過度負荷反應(ER over-load response，EOR);(3)固醇調節元件結合蛋白質(sterol regulatory element binding protein，SREBP)通路調節反應。目前對UPR的研究比較深入，機制較為清楚，如果沒有特殊說明，通常所說的ERS是指UPR［5］。

UPR是指內質網應激發生時，細胞自身通過減少蛋白質的合成，或增強內質網的蛋白折疊功能及內質網相關性蛋白降解途徑(ER associated degradation，ERAD)的過程。UPR激活利于恢復細胞內環境的穩定，提高細胞在有害因素下的生存能力。但是當ERS非常劇烈或者持久時，細胞損傷過于嚴重，UPR不能使細胞內環境穩態及時恢復到正常，最終凋亡機制就會被觸發，導致細胞死亡。

2 內質網應激的UPR信號轉導與腦缺血/再灌注損傷

2.1 內質網應激的UPR信號轉導途徑 內質網應激誘導的UPR細胞信號轉導通路主要包括3條:即PERK(protein kinase R—like ER kinase)通路、ATF6(activating transcription factor 6)通路、IRE1(inositol—requiring enzyme 1)通路。無應激狀態下，PERK、ATF6、IRE1三種跨膜蛋白分別與內質網分子伴侶葡萄糖調節蛋白78/免疫球蛋白結合蛋白(glucoseregulated protein 78/binding immunoglobulinprotein，GRP78/BiP)結合而處于失活狀態。當 ERS發生時，GRP78與PERK、ATF6、IRE1解離，各跨膜蛋白自身結構域感應應激，拉響應激信號的警報，并將此信號傳遞給下游信號通道，對細胞進行保護。

2.1.1 IRE1/X盒蛋白l通路 IRE1是內質網I型跨膜蛋白，具有絲/蘇蛋白激酶和位點特異的核酸內切酶活性。內質網中錯誤折疊蛋白的出現，使IRE1與GRP78分離，并形成同源二聚體，發生自身磷酸化被激活。IRE1激活后，能剪切XBP1mRNA中一個26bp長度的內含子，形成具有轉錄因子活性的 XBP1s蛋白［9］。XBP1s與已知的啟動子元件結合，上調內質網應激的相關基因表達［6－7］

2.1.2 ATF6通路 ATF6是內質網Ⅱ型跨膜蛋白，有高爾基體定位信號能夠感知應激［12］。ERS發生時，錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白堆積促使GRP78和ATF6分離，ATF6轉移至高爾基體。在高爾基體內，ATF6被特異蛋白酶位點l和特異蛋白酶位點2裂解，形成同源二聚體或與其他轉錄因子形成異源二聚體，激活XBP1和其他UPR靶向基因［8］

2.1.3 PERK信號通路 PERK是內質網的I型跨膜絲/蘇蛋白激酶，屬于真核細胞翻譯起始復合物2α(eIF2α)激酶家族成員。ERS時，PERK與GRP78解離后形成同源二聚體，發生自身磷酸化被激活。PERK激活后，主要特異性磷酸化eIF2α，下調eIF2α活性水平，降低新生蛋白的翻譯速率，下調細胞內蛋白質合成的整體水平，保護內質網的功能［9］。此外，PERK介導的eIF2α磷酸化還導致轉錄因子ATF4上調。ATF4進入胞核后激活C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein，CHOP)、生長抑制DNA損害誘導基因34、ATF3及關于氨基酸轉運基因編碼蛋白的表達，而且還抑制氧化應激。

2.2 腦缺血/再灌注損傷與內質網應激相關性死亡 腦缺血/再灌注時，細胞凋亡增加是腦組織損傷的重要原因。而缺血/再灌注及缺血缺氧性損傷是ERS發生的重要條件，細胞通過ERS自身產生應激性保護措施。但是劇烈或持久的ERS會誘導caspase-12、CHOP等表達，激活凋亡信號通路，誘導細胞凋亡，加重腦缺血/再灌注損傷。

2.2.1 腦缺血/再灌注損傷Ca2+濃度變化與內質網應激腦缺血是造成腦組織細胞內質網損傷的重要因素，尤其是在再灌注時。在缺血區，由于神經元缺少氧氣和能量，導致細胞膜損傷及其功能障礙，引起跨膜離子濃度失衡，導致細胞外Ca2+內流增加;缺氧還會致使NO產生，這也促使內質網中Ca2+釋放［10］;這些因素最終導致細胞內Ca2+超載。內質網腔內的Ca2+主要發揮兩種作用:一是釋入胞質作為第二信使;二是在內質網腔內調節蛋白酶活性。內質網大量Ca2+釋入胞質會對細胞功能和狀態產生嚴重而廣泛的影響，如會破壞內質網與高爾基體之間以及胞核與胞質之間的膜轉運等。另一方面，內質網依靠多種Ca2+依賴性蛋白酶的調節生成和加工分泌性蛋白質，因此Ca2+從內質網腔大量釋出后，這些蛋白酶失去活性，導致蛋白質前體未經折疊、加工或錯誤折疊而在內質網腔內積聚，最終導致內質網應激發生。

2.2.2 腦缺血/再灌注損傷活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)產生與內質網應激 在能導致內質網應激的各種刺激中，活性氧是造成該細胞器嚴重損害的重要分子之一。內質網膜結構豐富，含有大量脂質，當產生ROS時很容易發生脂質過氧化反應，導致內質網功能嚴重障礙。腦缺血/再灌注過程中產生大量ROS，影響內質網膜上的鈣離子泵功能，從而逐步耗竭內質網的Ca2+，引起細胞內游離Ca2+增加，誘發內質網應激和細胞凋亡［11］。此外，在腦缺血/再灌注過程中，缺血組織生成NO增多，導致過氧化亞硝酸鹽也很容易在內質網產生。過氧化亞硝酸鹽是一個毒性很高的分子，可能通過酪氨酸殘基硝基化使各種蛋白功能受損。也有人認為，過多的NO可直接干擾內質網的功能，激活ERS。但是，NO激活ERS反應的機制還有待進一步的研究［10］。大量的研究表明內質網應激在缺血性神經細胞死亡中發揮積極作用。在A Young Cho研究中［12］，用thapsigargin和brefeldin A導致內質網應激誘導HT22鼠海馬神經元細胞凋亡，發現thapsigargin和brefeldin A可使活性氧的產生和積聚是內質網應激的主要誘因。

2.2.3 腦缺血/再灌注損傷炎癥發生與內質網應激 近來研究表明，腦缺血/再灌注后局部過度的炎癥反應是引起再灌注損傷的主要原因之一。炎癥反應可抑制神經元再生及其它與腦卒中后功能恢復相關的變化［13］。腦缺血/再灌注早期，血腦屏障破壞，通透性增加，引起白蛋白和其他大分子蛋白滲出，導致了水腫。此外，釋放的超氧陰離子等和NO反應生成氧亞硝酸鹽，觸發炎癥反應和細胞凋亡，引起進一步的組織損傷。缺血/再灌注后期，炎癥基因激活，產生白介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor，TNFα)、干擾素調節因子(interferon regulatory factor，IRF)、NF-κB 等炎癥介質，促進中性粒細胞貼壁和跨膜遷移，促進白細胞浸潤，釋放細胞因子和趨化因子，引起更廣泛的腦組織固有細胞激活和血源性白細胞浸潤，最終導致血腦屏障進一步受損，加重腦水腫，出現神經元遲發性死亡。可見腦缺血/再灌注可致炎癥級聯反應發生，進一步加重了腦組織損傷［14］。

研究表明，炎癥和 ERS之間存在著廣泛的聯系［15－17］。有資料表明，LPS(Lipopolysaccharide)、IL-1β、IL-6、TNFα 等炎癥因子均可引起ERS，但其機制目前還不清楚［18，19］。另外，ERS也會促進炎癥發生。現已明確，NF-κB是重要的轉錄調控因子，在炎癥反應發生過程中發揮主導作用。越來越多的資料表明［20－22］，某些藥物對腦缺血/再灌注損傷的保護作用就是通過抗炎抗凋亡作用實現的，而這作用與抑制NF-κB的活化相關。ERS發生時，PERK-eIF2α介導的翻譯減緩直接促進NF-κB激活［23］，由于 IκB的半衰期明顯短于 NF-κB，PERK-eIF2α 介導的翻譯抑制作用增加了 NF-κB/IκB 的比值，因此，游離的NF-κB轉位到細胞核增多，促進炎癥反應發生。此外，ERS發生時，IRE1α通路激活，IRE1α發生磷酸化，構象發生改變，與接頭蛋白分子TNFα受體相關因子2(tumor necrosis factor-2，TRAF2)結合，形成 IRE1α-TRAF2 復合物。此復合物能夠募集IκB激酶，使IκB磷酸化并降解，致NF-κB核轉位增加，激活促炎癥反應基因的轉錄。IRE1-TRAF2復合物還能夠募集并活化蛋白激酶JNK，進而磷酸化和活化轉錄因子AP1，增加促炎癥基因的表達。除了這兩條通路外，ERS時ATF6通路也會促進NF-κB激活［19］。

另外，也有人認為［24－25］，在炎癥早期階段，ERS 促進NF-κB活化，產生炎癥;在炎癥后期，ERS可通過誘導NF-κB抑制因子A20的表達，抑制NF-κB的活性，抑制促炎因子的表達。根據這些研究結果，如何用藥物干預腦缺血/再灌注過程炎癥的早期階段，減弱內質網應激，減少炎癥損傷，發揮神經保護作用，值得深入研究。

2.3 內質網應激相關性死亡途徑 內質網應激是應激條件下發生在細胞中的最初反應，蛋白質合成的暫停減輕了新生蛋白肽鏈對ER的負荷與壓力，是細胞本身的一種自我保護性機制。但是，長時間的ERS會使未折疊蛋白持續增加，引起細胞功能失調，ERS由促細胞生存的保護效應向促細胞凋亡效應轉化［26］。ERS引起的細胞凋亡有一套自身的信號傳遞通路，稱為內質網相關性死亡(ERAD)途徑。

2.3.1 Caspase-12的激活 Caspase-12定位于ER外膜，是ERS誘導凋亡的特異性蛋白酶，也是介導ERS凋亡的關鍵分子，能夠單獨通過內質網途徑而不通過其他凋亡途徑誘導細胞凋亡。非ERS時，caspase-12與蛋白分子伴侶BiP和caspase-7形成復合體，細胞不會表現凋亡;但是ERS時BiP減少，無法與 caspase-7、caspase-12充分結合，caspase-12激活［27］，從而進一步激活 caspase-9，caspase-9 把信息傳遞給caspase-3引起細胞最終凋亡。還有資料證實［28］，caspase-12－/－大鼠對ERS誘導的凋亡具有抵抗作用，而對于其他途徑誘導的凋亡敏感性不變，進一步說明了ERS介導caspase-12凋亡途徑。而M.SHIBATA等也在他們的實驗研究中指出［29］，局灶性腦缺血/再灌注損傷引起內質網應激，激活caspase-12，誘導神經元凋亡。最近的研究也表明，對原代培養的大鼠神經元，進行缺氧復氧損傷或谷氨酸損傷，能引發ERS，上調caspas-12表達，而牛磺酸通過抑制ATF6和IREα通路減弱ERS，發揮細胞保護作用［30］。但是，目前，caspase-12只在大鼠和小鼠體內被克隆［31］。研究發現，人類的caspase-4與鼠caspase-12具有高度同源性，在內質網介導的凋亡途徑起到重要作用［32，33］，可能是腦卒中潛在的治療靶點。

2.3.2 CHOP轉錄激活 CHOP是內質網應激特異的轉錄因子，屬C/EBP轉錄因子家族成員，也稱GADD153。正常情況下，胞內CHOP表達十分低。當ERS時，其表達明顯增加。ERS使跨膜蛋白IRE1和ATF6活化，其胞質部分進入胞核，與ERSE保守序列相連，而啟動CHOP的轉錄和表達。此外，PERK通路激活，磷酸化 eIF2α增加，誘導轉錄因子ATF4表達，ATF4可與CHOP啟動子的氨基酸反應元件位點結合，激活CHOP。PERK信號激活在ERS早期通過抑制蛋白質合成對細胞起保護作用，但 ERS時間過長，持續的PERK信號誘導CHOP表達而促進細胞凋亡［34］。

很多資料證實，內質網應激誘導劑thapsigargin和tunicamycin均可使CHOP表達上調，促進凋亡;對原代培養的大鼠心肌微血管內皮細胞，進行缺氧/復氧損傷，CHOP表達升高，細胞凋亡增加;而缺氧預適應則通過下調其表達，減少缺氧/復氧引起的細胞凋亡［35］。研究證實［36］，小鼠腦缺血損傷后在相同時間點當CHOP表達升高時，GRP78的表達會降低，表明CHOP的表達可破壞GRP78保護機制而誘導神經元凋亡。另有資料證實，大鼠短暫局灶性腦缺血海馬CHOPmRNA水平升高。而且，在雙側頸總動脈結扎的小鼠缺血模型，CHOP－/－小鼠梗死面積要小于野生型小鼠。越來越多的資料證明，CHOP表達增加是ERS引起細胞凋亡的重要原因。關于CHOP凋亡通路，可能有以下幾種:(1)CHOP下調Bcl-2水平，上調Bcl-2家族成員BH3的預凋亡基因Bim，使細胞對ERS的敏感性增加［37］;(2)CHOP的目靶基因可能是TRB3，研究發現，剔除TRB3基因的表達可以降低ERS誘導細胞凋亡的能力［38］;(3)CHOP可能通過上調巰基氧化酶Ero-1的水平，使Ero-1作為活性氧簇的副產物而激活凋亡程序［39］。綜上所述，CHOP表達可能與細胞凋亡密切相關。CHOP可能是治療繼發性腦損傷中一個重要靶點。

2.3.3 c-jun氨基末端激酶(JNK)誘導的凋亡途徑 ERS時，IRE1激活c-jun氨基末端激酶(JNK)，誘導凋亡。一種方式是:c-jun氨基末端激酶磷酸化TRAF2，再與caspase-12作用，促進其聚合和活化;另一種方式是:IRE1/TRAF2/凋亡信號調節激酶1(ASK1)形成復合物，激活c-jun氨基末端激酶，依賴線粒體/Apaf-1途徑誘導細胞凋亡［40］。有資料顯示，在ASK1－/－細胞中，ERS則不能誘導JNK的激活以及細胞凋亡，表明ASK1是ERS誘導JNK的激活以及細胞凋亡所必需的。最近的研究也表明，腦缺血/再灌注損傷的病理過程中，NO生成可以激活ASK1，從而進一步激活其下游的的JNK 通路［27，41］;此外，有人認為再灌注早期 CHOP 轉錄激活是導致再灌注損傷的主要原因，它和caspase-12的激活導致ERS級聯反應發生，誘導細胞凋亡［27］。而c-jun氨基末端激酶對caspase-12誘導的凋亡途徑影響更為顯著。該研究提示，腦缺血/再灌注早期應用c-jun氨基末端激酶的抑制劑，可減弱ERS和細胞凋亡，減輕腦缺血/再灌注損傷。

3 小結與展望

腦缺血/再灌注損傷的病理生理過程中，細胞內Ca2+平衡紊亂，ROS和NO產生增加及炎癥反應等均能觸發ERS。GRP78作為ERS敏感標志物，其表達的增加提示缺血/再灌注出現了ERS。在Yajing Yuan缺血后處理保護I/R損傷的研究中［42］，缺血后處理增加 GRP78的表達，降低腦組織CHOP表達，降低casepase-12活性，表明缺血后處理也可通過抑制內質網應激誘導的細胞凋亡發揮腦保護作用;已有資料證實，依達拉奉不論對腦缺血/再灌注的動物模型還是對腦卒中病人均能減少腦梗塞面積和腦水腫［43－44］，其神經保護作用實驗證實也與其減少CHOP和capase-12的表達有關［45］。Nakka 等研究表明［4］，大鼠腦缺血/再灌 注 后，GRP78、caspase-12、CHOP/ATF4 及 XBP1 表達上調，對 eIF2α去磷酸化的抑制能增加eIF2α磷酸化的表達，對抗ERS，減輕腦缺血/再灌注損傷。

綜上所述，ERS凋亡途徑是腦缺血/再灌注過程中神經元死亡的重要方式之一。研究腦缺血/再灌注損傷和ERS的關系能為腦卒中的研究提供重要理論基礎，抑制內質網應激有望阻止腦缺血后的病理過程，這將為腦卒中的治療和藥物發現提供新思路。

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