以新視角觀察p53家族在肺癌發(fā)生及治療中的獨(dú)特作用

黃文彥 劉凱珊

P53基因開(kāi)始時(shí)被認(rèn)為是原癌基因，后來(lái)的研究才得以證實(shí)p53其實(shí)是抑癌基因[1]。人類p53基因定位于17號(hào)染色體的短臂，有11個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄成2.5 Kb mRNA，編碼393個(gè)氨基酸，分子量為53 kDa。P53蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可分為N末端的轉(zhuǎn)錄激活（transaction, TA）結(jié)構(gòu)域，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域及四聚體寡聚化結(jié)構(gòu)域，根據(jù)N末端不同的啟動(dòng)位點(diǎn)及C末端α、β、γ3種不同剪切可分為9種不同的亞型，其N(xiāo)端含TA結(jié)構(gòu)的亞型有轉(zhuǎn)錄激活的功能，N端為delta亞型則喪失轉(zhuǎn)錄激活功能，起著顯性失活的作用。P63、p73與p53在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域上有高度的同源性，允許p63、p73與p53-反應(yīng)基因相結(jié)合起著轉(zhuǎn)錄激活的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)p63有6種亞型，p73有29種亞型[2]。P53作為轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞受到損傷時(shí)可以直接激活周期依賴激酶抑制劑，p21等誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，或者通過(guò)激活促凋亡基因如bax、puma、scotin等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。全長(zhǎng)的p53很快被MDM2等降解，在外來(lái)刺激強(qiáng)烈的情況下，p53會(huì)發(fā)生突變或其它變化，使p53喪失轉(zhuǎn)錄激活的功能致使腫瘤發(fā)生并具有增加惡性、患者的不良生存及對(duì)治療的抵抗等特征。

肺癌源于支氣管上皮，可分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）及非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）兩大類，其中NSCLC又包括鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌。SCLC對(duì)首次化療較NSCLC敏感，但更容易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后產(chǎn)生化療抵抗，使預(yù)后不良[4]。肺癌的發(fā)病率很高，多數(shù)與吸煙相關(guān)，雖然外科手術(shù)和放化療的治療技術(shù)都在進(jìn)步，但肺癌的預(yù)后仍然較差。肺癌的發(fā)生涉及多種基因多步驟的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程，其中p53家族成員起著重要作用。

1 P53家族成員在肺癌發(fā)生中的作用

1.1 P53突變與肺癌的發(fā)生 P53突變發(fā)生在許多人類腫瘤中，多達(dá)50%的人類腫瘤出現(xiàn)p53的等位基因突變[5,6]，與其它抑癌基因不同的是，p53主要發(fā)生錯(cuò)義突變，導(dǎo)致單個(gè)氨基酸的改變，從而在不同的水平上影響著p53的轉(zhuǎn)錄活性[7]，而在人類肺癌中超過(guò)90%的p53錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致其異常積累，引起突變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性增加[5]。P53突變常導(dǎo)致表達(dá)一個(gè)擁有“獲得性功能”（gain of function,GOF）的穩(wěn)定的突變蛋白質(zhì)。在肺癌中，有33%的腺癌和70%的SCLC發(fā)生p53突變，而且，p53突變的肺癌細(xì)胞預(yù)后不良并對(duì)化療藥物和放療更加抵抗，許多不同的表型歸因于GOF的活化，包括增加致癌性，增加腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的能力，降低對(duì)化療藥物的敏感性，增加生存率，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力等[8]。

在肺癌的細(xì)胞系和病理標(biāo)本中經(jīng)常都可以檢測(cè)出17號(hào)染色體p53基因的位點(diǎn)上發(fā)生雜合性缺失（loss of heterozygosity, LOH），研究表明盡管有p53突變基因的積累，但在p53功能喪失的肺癌細(xì)胞中重新加入正常的p53可以恢復(fù)其腫瘤抑制能力，這表明LOH可能與肺癌的發(fā)生相關(guān)[9]。免疫組化的研究[10]結(jié)果表明，在NSCLC臨床標(biāo)本中鱗癌的p53突變頻率最高于腺癌。P53突變常發(fā)生在外顯子5-8的區(qū)域，運(yùn)用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析及PCR擴(kuò)增片段的變性梯度凝膠電泳技術(shù)可檢測(cè)p53的突變位點(diǎn)[11,12]。P53突變是肺癌發(fā)生的早期事件，在支氣管癌早期就能檢測(cè)出分子損傷，而k-ras癌基因突變則在支氣管癌中出現(xiàn)較遲，通常不能在癌前病變檢測(cè)出來(lái)[13]。

1.2 P63、p73與肺癌的發(fā)生 P63有P1、P2兩個(gè)啟動(dòng)子和α、β、γ三個(gè)不同的C末端剪切，共有TAp63和△Np63兩大類共 6種蛋白質(zhì)；p73中TAp73、外顯子2p73（Exons2p73，EX2p73）、外顯子2/3p73（Exons2/3p73，EX2/3p73）、△N'p73的啟動(dòng)子為P1，C末端有α、β、γ、δ、ε、ζ、η7種不同的剪切，△Np73的啟動(dòng)子為P2，缺乏DNA結(jié)合與C末端的結(jié)構(gòu)域，所以p73共編碼29種蛋白質(zhì)[2,3]。P63、p73與p53不同的是很少發(fā)生突變，而是通過(guò)表達(dá)有N-末端刪節(jié)的△Np63、△Np73起到抗凋亡的作用，與之相反的是有轉(zhuǎn)錄激活功能的TAp63、TAp73，后兩者與p53都起著細(xì)胞周期阻滯及誘導(dǎo)凋亡的功能[14,15]。△Np63、△Np73可通過(guò)顯性失活的作用抑制其TA亞型或者p53的誘導(dǎo)凋亡作用，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)p63、p73△:TA的比例，而不是單個(gè)的亞型，在腫瘤的發(fā)生中起著一定的作用。在膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌和大腸癌中p63、p73的異常表達(dá)尤為明顯[16]。

與其它惡性腫瘤一樣，肺癌中p63、p73異常表達(dá)的作用及地位相當(dāng)復(fù)雜，目前仍比較有爭(zhēng)議。88%的鱗癌，42%的大細(xì)胞肺癌及11%的腺癌出現(xiàn)p63基因的擴(kuò)增，主要改變的亞型是△Np63α，并且主要表達(dá)在正常支氣管上皮及鱗癌中，少有表達(dá)在正常肺組織及腺癌中，提示了p63基因序列的擴(kuò)增可能參與了肺鱗癌的發(fā)展。在一項(xiàng)組織芯片的檢測(cè)中得出同樣的結(jié)論，并且提示p63免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)與3號(hào)染色體長(zhǎng)臂27-29區(qū)域的DNA擴(kuò)增呈顯正相關(guān)，p63基因的擴(kuò)增與肺鱗癌發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切[17,18]。另外基因芯片檢測(cè)也顯示肺鱗癌中有3q26-29明顯擴(kuò)增[19]。一項(xiàng)關(guān)于肺癌患者標(biāo)本中△Np73的檢測(cè)顯示，有77/132（58.3%）肺癌細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)出△Np73的陽(yáng)性表達(dá)，且預(yù)后不良[20]。NSCLC患者的肺癌標(biāo)本實(shí)驗(yàn)顯示，p63、p73中N末端△:TA的比例發(fā)生失調(diào)，特別是△Np63明顯的上調(diào)而TAp63卻明顯地下調(diào)，同樣地，△2p73和△2/3p73都上調(diào)了，而△Np73和△N'p73都下調(diào)了，提示了p63、p73中△:TA表達(dá)的異常可能對(duì)NSCLC的發(fā)生起著一定的作用[21,22]。P73基因的第二外顯子的非編碼區(qū)有多態(tài)性表現(xiàn)，會(huì)改變p73的翻譯效率，相對(duì)于GC/GC基因型，GC/AT與AT/AT基因型對(duì)增加肺癌的風(fēng)險(xiǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[23]。

2 P53家族成員對(duì)肺癌化療敏感性的影響

腫瘤細(xì)胞有無(wú)限增殖的潛能，并且通過(guò)各種機(jī)制逃避凋亡。DNA損傷藥物表現(xiàn)出明顯的腫瘤細(xì)胞毒性，運(yùn)用DNA損傷藥物治療腫瘤可以使腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)多種方式的細(xì)胞死亡，如衰老、有絲分裂失敗、凋亡等。P53的狀態(tài)在這些DNA損傷藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性中占有重要地位。TAp63/△Np63、TAp73/△Np73的比例及突變型p53（mutant type p53, MTp53）的水平對(duì)化療的效果有一定影響。對(duì)△Np63、△Np73、MTp53實(shí)施干擾能夠增強(qiáng)化療的敏感性及降低腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。P53的不同亞型在誘導(dǎo)凋亡中發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能，p53β更易于結(jié)合到p21和bax，而不易結(jié)合到MDM2，共轉(zhuǎn)染p53β可輕微增加p53介導(dǎo)的凋亡[24,25]。

2.1 p53與肺癌的化療敏感性 MTp53可導(dǎo)致NSCLC增加化療抵抗。NSCLC患者的臨床病理標(biāo)本中MTp53的表達(dá)與以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療抵抗有密切的聯(lián)系[26,27]。重組腺病毒治療在臨床試驗(yàn)中證實(shí)可增強(qiáng)化療的敏感性，在NSCLC實(shí)體瘤中注射野生型p53（wild type p53, WTp53）聯(lián)合順鉑等化療可取得較好的抗癌效果[28,29]。增加細(xì)胞內(nèi)的p53濃度能夠擴(kuò)大順鉑和紫杉醇在NSCLC中的化療效果。但也有研究表明單獨(dú)轉(zhuǎn)染W(wǎng)Tp53不足以很大程度上改變肺癌細(xì)胞系的化療敏感性，而且，WTp53可誘導(dǎo)環(huán)氧化酶的生成，后者表現(xiàn)出抑制化療誘導(dǎo)的凋亡[30,31]。WTp53第4外顯子72密碼子處存在單個(gè)核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism, SNP），對(duì)肺癌的化療敏感性有一定影響，臨床研究發(fā)現(xiàn)，攜帶p53 72PRO等位基因肺癌患者的化療敏感性明顯高于攜帶ARG/ARG基因型的患者[32]。

2.2 P63、p73與肺癌的化療敏感性 TAp63α在化療敏感性上占據(jù)一定的地位，TAp63α可以被多種藥物誘導(dǎo)凋亡，研究顯示，TAp63α的過(guò)表達(dá)與腫瘤的化療敏感性有關(guān)，TAp63α的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致化療抵抗。△Np63可直接影響一些頭頸部腫瘤對(duì)順鉑的化療敏感性，并可以作為重要的預(yù)后因子。有關(guān)p63與肺癌化療敏感性的研究目前開(kāi)展得較少[24]。

P73被證實(shí)了可以被多種細(xì)胞毒性藥物誘導(dǎo)使細(xì)胞發(fā)生凋亡，如喜樹(shù)堿、依托泊苷、順鉑、阿霉素及紫杉醇等。TAp73可被MTp53結(jié)合而發(fā)生顯性失活，也能被siRNA抑制而發(fā)生失活，導(dǎo)致人類腫瘤細(xì)胞的化療抵抗和造成細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。運(yùn)用siRNA減少M(fèi)Tp53能增強(qiáng)腫瘤的化療敏感性，支持了MTp53能通過(guò)中和TAp73來(lái)誘導(dǎo)化療抵抗[33]。研究顯示70%的人類腫瘤可表現(xiàn)出△Np73的上調(diào)，△Np73通過(guò)絡(luò)合物的形成來(lái)抑制WTp53及TAp73的誘導(dǎo)凋亡功能，而通過(guò)特異性siRNA來(lái)抑制△Np73的表達(dá)能夠提高化療的敏感性。P73β的過(guò)表達(dá)能通過(guò)誘導(dǎo)p53依賴的凋亡通路來(lái)提高化療敏感性，所以可以用于治療p53抵抗的腫瘤[34]。

3 P53家族成員與肺癌的靶向治療

放療和化療目前還是肺癌的主要治療手段，但效果欠佳，肺癌靶向治療是一個(gè)很有希望的研究方向，各種恢復(fù)失活p53的轉(zhuǎn)錄激活功能的研究目前正在廣泛開(kāi)展。一些策略正研究作用于失活/被抑制的p53，使其恢復(fù)WTp53的功能，如使突變的p53重新獲得轉(zhuǎn)錄激活的功能。這些藥物包括一些短多肽、小分子藥物及重組腺病毒。

3.1 解除MDM2對(duì)p53、p73的抑制作用 E3泛素化連接酶MDM2是p53的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，在一些肉瘤中經(jīng)常過(guò)表達(dá)。MDM2可抵消p53的腫瘤抑制功能，主要通過(guò)三個(gè)方面的機(jī)制：①與p53直接結(jié)合，阻礙后者的轉(zhuǎn)錄激活功能；②通過(guò)核輸出p53使p53局限化；③介導(dǎo)p53的泛素化降解[35,36]。一系列MDM2的小分子抑制劑（molecule inhibitor, MI）如Nutlins、Cis-imidazoline等，正研究用于結(jié)合到MDM2上而干擾后者對(duì)p53的抑制作用，使腫瘤細(xì)胞的被抑制的WTp53可以重新激活[37]。Nutlin-3可在紫杉醇的化療中保護(hù)正常細(xì)胞而選擇性地增加肺癌細(xì)胞的凋亡。Nutlin-3能下調(diào)肺癌細(xì)胞中TNF-α對(duì)NFκB的誘導(dǎo)激活，增強(qiáng)p53的轉(zhuǎn)錄激活功能而降低癌細(xì)胞的生存能力[38]。Nutlin還能增加肺癌的放療敏感性[39]。MI-43在低濃度中可誘導(dǎo)p21而造成細(xì)胞在G1期或G2期阻滯，在高濃度時(shí)可以通過(guò)激活puma/noxa而誘導(dǎo)凋亡，呈劑量依賴性[40]。MDM2同樣可影響p63、p73的功能，MDM2不介導(dǎo)對(duì)p73的降解，但可抑制p73的轉(zhuǎn)錄激活功能，基于Nutlin-3在MTp53的腫瘤細(xì)胞中仍然能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡[41]，所以可以假設(shè)Nutlin-3同樣可以把p73從后者與MDM2的結(jié)合中釋放出來(lái)，而激活下游的noxa、puma和p21，增強(qiáng)凋亡和細(xì)胞阻滯。同時(shí)，Nutlin-3可以提高缺乏p53的神經(jīng)母細(xì)胞瘤對(duì)阿霉素的化療敏感性[42]。

3.2 短多肽/小分子藥物對(duì)突變p53的重激活作用 一些短多肽可以令一些未折疊的MTp53實(shí)現(xiàn)重折疊而使后者的活性與WTp53的活性一致。CDB3可重折疊MTp53但不影響p53對(duì)DNA的結(jié)合，這種重折疊可以是直接結(jié)合，也可以是通過(guò)分子伴侶實(shí)現(xiàn)[43]。在肺癌細(xì)胞系中，p53結(jié)合蛋白質(zhì)2/p53相關(guān)凋亡刺激蛋白質(zhì)（p53 binding protein 2/apoptosis stimulating protein of p53, 53BP2/ASPP）可以增強(qiáng)p53的轉(zhuǎn)錄激活的功能而與p53的狀態(tài)無(wú)關(guān)，同時(shí)可以增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)紫外線和X-線的敏感性[44]。53BP2L/ASPP2可特異性地增強(qiáng)p53-誘導(dǎo)的凋亡通過(guò)提高p53啟動(dòng)子和促凋亡基因的DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄激活功能，如bax[45]。在肺癌細(xì)胞中某些熱點(diǎn)突變的p53可以抑制p73介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活功能[46]，在其它腫瘤細(xì)胞研究中，一些短多肽可以把與MTp53結(jié)合的p73游離出來(lái)，這一策略可以提高p73的促凋亡活性，并且提高化療敏感性[33,43]，可設(shè)想研究用于肺癌細(xì)胞治療上。小分子藥物如Ellipticine、p53-依賴性重激活和誘導(dǎo)大量凋亡（p53-dependent reactivation and induction of massive apoptosis, PRIMA-1）、p53重激活和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（reactivation of p53 and induction of tumour cell apoptosis, RITA）等可恢復(fù)MTp53的轉(zhuǎn)錄活性。PRIMA-1可抑制表達(dá)MTp53的癌細(xì)胞生長(zhǎng)，激活p53靶向的mdm2、p21、puma等基因[43]。在肺癌細(xì)胞系中，PRIMA-1可增強(qiáng)p53依賴的細(xì)胞凋亡或協(xié)同化療藥物的效果[47,48]。

3.3 重組腺病毒的靶向治療 針對(duì)p53突變或者缺失的癌細(xì)胞，可用腺病毒為載體將WTp53輸入，使癌細(xì)胞重新獲得p53介導(dǎo)的抗癌能力。肺癌細(xì)胞中的p53突變廣泛存在，目前，重組人p53腺病毒結(jié)合化療治療肺癌已經(jīng)進(jìn)行了臨床前和臨床測(cè)試[49]，細(xì)胞系研究顯示，重組人p53腺病毒注射液能抑制肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并不受內(nèi)源性p53狀態(tài)的影響。它與抗癌藥順鉑聯(lián)用能明顯增加肺腺癌細(xì)胞的化療敏感性[50]。一項(xiàng)涉及49例NSCLC的臨床研究[51]顯示，19例患者運(yùn)用支氣管動(dòng)脈融合結(jié)合重組腺病毒治療比49例單純用支氣管動(dòng)脈融合治療能夠提高患者的生活質(zhì)量和延遲疾病的進(jìn)展。

綜上所述，p53家族成員之間的的作用與聯(lián)系為肺癌的發(fā)生，化療敏感性及靶向治療上提供了新的研究方向，在細(xì)胞系和肺癌標(biāo)本上做基因或蛋白質(zhì)水平的分子基礎(chǔ)、調(diào)控作用的研究已經(jīng)廣泛開(kāi)展，p53的基因治療已應(yīng)用到肺癌的臨床治療中，但是，還有很多問(wèn)題需要深入解決。例如，p53家族里各個(gè)亞型之間的相互作用，基因多態(tài)性的影響如何等。因此，對(duì)于p53家族成員與肺癌的關(guān)系的研究有待進(jìn)一步深化和廣泛化。