半乳凝素-3在非小細胞肺癌中的表達及相關性研究

劉美燕 杜冰 李春紅 趙艷濱 孟慶威 蔡莉

半乳凝素-3（Galectin-3）能與β-半乳糖苷特異性結合，參與許多生理和病理過程，在調解機體免疫、細胞粘附、炎癥反應、細胞凋亡、血管侵襲等諸多方面起著重要的作用[1]，且與腫瘤的轉移及預后有關。目前，在許多惡性腫瘤中都發現了Galectin-3的表達，但在不同的腫瘤中，Galectin-3的表達水平不同。在肺癌中的研究比較少。

本實驗運用免疫組化法和RT-PCR方法，結合完整的臨床資料檢測Galectin-3在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中的表達，分析Galectin-3的表達與NSCLC發生發展的關系，并探討其表達與臨床病理特征之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 17例正常肺組織取于哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院2006年10月-2007年2月液氮凍存組織，52例NSCLC組織標本取自哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院2006年1月-2007年5月手術切除病理存檔蠟塊，52例組織均有良好隨訪記錄（＞50個月），所有手術患者術前均未接受過放療、化療，診斷均經常規病理切片證實。組織均經甲醛固定，石蠟包埋，厚4 μm連續切片，分別作HE和免疫組化染色。10例NSCLC組織為哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院2006年11月-2007年2月手術切除的新鮮肺癌組織，所有原發腫瘤標本在切除后被立即分成兩部分：一部分經甲醛固定、石蠟包埋用于免疫組化檢測，另一部分儲存于液氮中用于RT-PCR檢測。

1.2 臨床及病理資料 62例NSCLC按國際抗癌聯盟2009年修訂的TNM分期標準分為：Ia期-IIb期29例，IIIa期-IIIb期33例；根據2011年WHO公布的肺癌組織分類標準判定病理類型和分化程度。肺腺癌32例，肺鱗癌30例；高分化24例，中分化17例，低分化21例；男性34例，女性28例；年齡從35歲-79歲，中位年齡為57.1歲。10例新鮮非小細胞肺癌組織中鱗癌6例，腺癌4例。

1.3 實驗試劑與方法

1.3.1 S-P法 一抗Galectin-3（NCL-GAL3）鼠單抗為Santa Cruz公司產品， UltrasensitiveTMS-P免疫組織化學染色試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司。DAB顯色劑購自福州邁新生物技術開發公司。免疫組化染色程序按S-P試劑盒說明書進行，一抗Galectin-3羊多抗（1:50），每批染色均設立陰性空白對照（以PBS液代替一抗）。

1.3.2 RT-PCR法 TaKaRa RNA PCR試劑盒購自大連寶生物公司；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司。DL2000 DNA Marker購自大連寶生物公司。RNA一步法提取總RNA，紫外分光光度計測量樣品濃度和純度，所得RNA260/280值在1.8-2.0，電泳18S和28S RNA條帶清晰。按Oligotex mRNA Midi Kit（MagExtractor公司）說明分離純化為mRNA。各引物均由大連寶生物合成，擴增條件：94oC、2 min，94oC、30 s，56oC、30 s，72oC、30 s。30個循環。RT-PCR所用的引物序列如下：Galectin-3上游：5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3'；下游：5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3'；β-actin上游：5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3'；下游：5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3'。

1.4 免疫組化結果 分別由兩名經驗豐富的病理醫師在不知臨床和病理資料的情況下獨立觀察切片，對免疫組化結果進行評估。Galectin-3主要表達于胞質和胞核中，陽性表達為黃色或黃棕色顆粒。按染色強度及染色細胞數量劃分等級，陰性（-）：顯色強度與背景無明顯差別；弱陽性（+）：顯色強度為淡黃色或僅個別細胞呈黃至棕黃色染色，陽性細胞數＜10%；中度陽性（++）：顯色強度呈黃至棕黃色染色，陽性細胞10%-60%；強陽性（+++）：顯色強度呈棕褐色，陽性細胞數＞60%。

1.5 隨訪 采用電話回訪和病案查詢的方式進行隨訪，記錄總生存期（overall survival, OS）。OS定義為從術后第一天至死亡或隨訪截止時間。隨訪截止于2012年12月31日。

1.6 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件，對數據進行χ2檢驗，非參數秩和檢驗及Spearman等級相關檢驗，P＜0.05有統計學差異。

2 結果

2.1 Galectin-3在NSCLC組織中的表達 Galectin-3在正常肺組織陽性表達率為11.76%（2/17），在NSCLC組織中陽性表達率為83.8%（52/62），二者差異有統計學意義（χ2=30.069, P＜0.001），即NSCLC組織中Galectin-3的陽性表達率明顯高于正常肺組織（圖1）。

2.2 Galectin-3的表達與臨床病理特征的關系 Galectin-3在NSCLC組織中的表達與患者的性別（χ2=0.113, P＞0.05）和年齡（χ2=0.220, P＞0.05）差異無統計學意義（表1）。Galectin-3在肺鱗癌中陽性率為86.2%（27/32），肺腺癌中陽性率為80.8%（25/30），二者之間無統計學差異（χ2=0.012, P＞0.05）（圖2）；Galectin-3與腫瘤的分化程度（χ2=8.577, P＜0.05）和臨床分期（χ2=5.287, P＜0.05）相關，其中與分化程度（r=-0.292, P＜0.05）的表達呈負相關，與臨床分期（r=0.336, P＜0.05）的表達呈正相關。

2.3 RT-PCR中Galectin-3的表達水平 RT-PCR 結果表明在10例新鮮NSCLC組織中無論是鱗癌組織還是腺癌組織Galectin-3均為高表達，其陽性表達率明顯高于正常肺組織（圖3）。這與免疫組化的結果是一致的，進一步證實了免疫組化的結果。

圖 1 Galectin-3在正常肺組織的陰性表達（S-P法，×200）Fig 1 The negative expression of Galectin-3 in lung tissue（S-P method, ×200）

圖 3 RT-PCR結果：Galectin-3在非小細胞肺癌組織中表達明顯高于正常肺組織Fig 3 Results of RT-PCR: Expression of Clusterin in lung cancer tissues was significantly higher than in normal lung tissues

圖 2 Galectin-3在肺腺癌和肺鱗癌中呈陽性表達（S-P法，A，B：×100；C，D：×400）Fig 2 The expression of Galectin-3 in lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma (S-P method, A, B: ×100; C, D: ×400)

2.4 Galectin-3的表達與患者生存率的關系 Galectin-3陽性表達的肺癌患者中位生存期為34.56個月，Galectin-3陰性表達的肺癌患者中位生存期＞80個月，存在統計學差異（P=0.045）（圖4）。

3 討論

Galectins是凝集素家族中的一員，能與β-半乳糖苷特異性結合。自1975年報道第一個哺乳動物Galectin以來，現已發現15個成員[2]。其中對Galectin-3的研究最為廣泛，它首先發現于巨噬細胞中，現在發現一些其它組織中也存在，如：腸、腦、腎、骨、肺、前列腺[3-5]及許多癌組織中。

圖 4 Galectin-3與總生存期的關系Fig 4 The realationship between Galectin-3 and overall survival

Galectin-3是半乳糖凝集素家族的重要成員之一，與細胞內的糖蛋白、細胞表面分子和細胞外基質作用，參與細胞粘附、增殖、凋亡、血管形成及mRNA剪切[1,6-7]等，與許多腫瘤的細胞增殖及侵襲、轉移等惡性生物學行為密切相關。目前，在許多惡性腫瘤中都發現了Galectin-3的表達，如乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、肝癌、星形膠質細胞瘤等[8-11]。Galectin-3不僅與腫瘤的發生有關，與腫瘤的轉移也有關聯[11]。已報道Galectin-3在多種腫瘤中過表達并參與腫瘤轉移的調控，包括胃癌、腦腫瘤、結腸癌和甲狀腺癌[12,13]。

肺癌是當今世界上嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，發病率在許多國家都有增高趨勢，根據WHO的數據，肺癌目前是全世界癌癥死因的第一名，約占全部惡性腫瘤的19%。全世界每年的新增病例超過120萬。在男性腫瘤死因中已居首位，在女性中僅次于乳腺癌居第二位。因此，早期診斷和治療極為重要。Mathieu等于2003年首次報道了Galectin-3基因在肺癌中的表達情況，其中NSCLC組中Galectin-3基因過表達，表達量是正常上皮細胞的3倍；相反，小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）者均不表達或低表達。此研究[14]還證實過表達的Galectin-3表達水平上調可能促進了NSCLC的轉移，但與SCLC轉移無關。Buttery等用免疫組化法對不同類型肺癌組織中Galectin-3的表達進行評估。證實在NSCLC中，Galectin-3呈高表達；而在SCLC中，Galectin-3表達水平及低。在NSCLC中，鱗癌與腺癌中Galectin-3的表達沒有明顯區別，且均表達在胞漿和胞核中[15]。在鱗癌細胞中，Galectin-3在不同分化程度的細胞中表達水平不同，腫瘤分化程度越低其表達水平越高，但差別沒有統計學意義。在腺癌細胞中，Galectin-3在不同分化程度的細胞中表達水平未見明顯不同[15]。

為了進一步觀察Galectin-3在NSCLC中的表達與臨床病理特征間的關系，為臨床診斷和預后尋找新的靶點，我們選取了62例NSCLC組織和17例正常肺組織進行了免疫組化方法檢測。結果顯示：NSCLC組織中Galectin-3的表達明顯高于正常肺組織，提示Galectin-3在NSCLC的發生發展中可能起一定的意義，與Buttery等的研究結果一致。另外我們發現NSCLC中不同的TNM分期、不同的病理分級與Galectin-3的表達具有相關性，癌組織的分化越差、分期越晚Galectin-3表達越高（P＜0.05），RT-PCR的結果進一步證實Galectin-3在肺癌組織中的表達明顯高于正常肺組織，說明其表達高低與腫瘤的惡性生物學行為有關。隨訪結果亦顯示Galectin-3與患者的總生存率相關，Galectin-3陽性表達的患者預后較差（P=0.045）。由此可見，Galectin-3可能是評價NSCLC預后的又一個重要基因，可能作為判斷NSCLC惡性程度及不良預后的生物學指標之一。

生物學標志物的不斷發現，為NSCLC的診斷和治療提供了重要線索。Galectin-3有望成為今后治療NSCLC的一個新靶點，與肺癌其它標志物聯合檢查以提高診斷率。總之，我們通過免疫組化方法檢測NSCLC組織及正常肺組織中Galectin-3蛋白的表達情況，分析發現Galectin-3蛋白的表達與患者的臨床特征及預后密切相關，對判斷NSCLC患者的預后具有重要意義。