星形膠質細胞Cx43 及縫隙連接通訊與缺血性腦卒中關系的研究進展

孫 嫄綜述，馮加純，鄧 方審校

星形膠質細胞是腦組織中數量最多的細胞，存在大量的縫隙連接蛋白(connexin，Cx)，在哺乳動物中以Cx43 為主。近年來國內外大量研究對星形膠質細胞Cx43 及其半通道、縫隙連接(gap junction，GJ)在缺血性腦卒中的作用意見不一，本文將探討目前這方面的研究情況。

1 Cx43、半通道及縫隙連接的基本結構與生理特性

目前已發現Cx 達21 種，腦內存在13 種。根據其來源、在核苷酸和氨基酸序列上的相似程度，可分為α 群:Cx33、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45、Cx46、Cx50、Cx57 和β 群:Cx26、Cx30、Cx31、Cx32，以及由神經元表達的γ 群--Cx36。所有這些Cx 均由同一基因家族所編碼，因而不同Cx 具有高度一致的結構特征。例如，Cx 氨基末端和羥基末端均存在于細胞質內，它們都具有4 個疏水的跨膜區、中間的親水段、2 個胞外環和l 個胞內環。其中氨基末端、4 個跨膜區和2 個胞外環都是高度保守區域，而羥基末端和胞內環則決定了Cx 結構的種屬特異性［1］。所以不同的Cx 具有不同的功能性質，如:電壓敏感性、滲透性等。不同類型細胞表達的縫隙連接蛋白也會不同，有些細胞可特定表達某些縫隙連接蛋白，如Cx30 和Cx43 可作為星型膠質細胞的標記物，Cx32 和Cx45則可作為少突膠質細胞的標記物。

星形膠質細胞存在大量的Cx，其中以相對分子質量為43kD 的Cx43 為主。6 個Cx 通過非共價鍵規律排列成的一個中空的親水連接子，成對的連接子在細胞膜處緊密相連形成GJ;而細胞膜上未配對的連接子，即半通道存在于縫隙連接周邊的非連接區胞膜上，主要調節細胞內Ca2+、ATP、NAD+水平，是細胞內外物質通訊的直接通道。生理情況下，GJ 處于開放狀態，允許相對分子質量小于1.5 kD 的分子，如第二信使、葡萄糖、谷氨酸、離子等代謝產物在細胞間進行交換，發揮縫隙連接通訊(Gap junctional intercellular communication，GJIC)功能。而半通道則處于關閉狀態或僅有極少量開放。這可能是因為構成GJ 的Cx43 已發生磷酸化，而單獨存在的半通道Cx43 和胞漿內的Cx43 并未有上述改變。

星形膠質細胞籍由GJ 可形成一個網絡式的功能合胞體，與遠隔區域的兄弟細胞形成分子聯系，與其相互呼應，在維持內外環境穩定、協調神經元功能、調節神經細胞的分化、發育中起重要作用［2］。另外膠質細胞的多種重要功能都與縫隙連接有關。譬如，星型膠質細胞的終足包裹著血管，提供神經元營養物質，而星型膠質細胞之間的縫隙連接更有利于其靠近脈管結構。而且，縫隙連接也被認為在髓鞘的產生和維持上起著重要作用。最近研究發現在海馬突觸傳遞、突觸可塑性及記憶認知功能的調節中，膠質細胞縫隙連接也起到重要作用。

2 Cx43、半通道及GJ 與缺血性腦卒中的關系

縫隙連接不僅存在于膠質細胞間，還架起了神經元與膠質細胞間的橋梁，在神經系統的信號傳遞及各種反應中發揮重要作用。有研究者發現神經膠質細胞自身可進行無氧代謝，因此比神經元更能耐受缺氧［3］。但一些本不足以影響神經膠質細胞的缺血事件卻可導致其功能降低，推測這種損傷是繼發于神經元死亡，GJ 在此起重要作用［4］。

2.1 Cx43 與缺血性腦卒中 生理條件下，星形膠質細胞Cx43 大多處于磷酸化狀態。研究證實缺血缺氧使Cx43去磷酸化，蛋白構象發生了變化，繼而引起功能變化。但Cx43 蛋白總量是否變化存在爭議。鄧方［5］通過星形膠質細胞體外缺氧模型發現Cx43 蛋白總量未見明顯變化，但分布變化明顯，縫隙連接出現一過性降低。Hugyecz［6］卻在全腦缺血模型后3 天發現Cx43 表達增加。分析可能由于模型不同，一方面細胞所處的內環境不同，另一方面體外實驗觀察的星形膠質細胞相當于缺血中心區，而體內實驗觀察的腦組織則不一定就是缺血中心區，這些因素可能導致上述二者之間差異。Hossain 等［7］在夾閉雙側頸動脈誘發輕度全腦缺血模型中，觀察到海馬和紋狀體Cx43 免疫反應性增高。重度全腦缺血模型中發現缺血中央區CX43 免疫反應性減弱，在其周圍即半暗帶Cx43 免疫反應性增強。在急性MCAO 模型中，缺血1、24h 后再灌注，發現在紋狀體、大腦皮質缺血中央區Cx43 缺失，而在半暗帶僅有少量CX43。說明不同程度腦缺血損傷時，Cx43 蛋白表達在空間和時間上也不同。

有研究指出，Cx43 不僅存在于細胞膜上，還存在于線粒體和細胞核等細胞器中。在損傷機制中，很多研究證實了Cx43 參與神經細胞凋亡。例如，存在于線粒體的Cx43，可以調節線粒體細胞色素C 釋放從而調節細胞凋亡。存在于細胞核內的Cx43 可能不依賴于GJ，而通過其C-末端調控基因表達促進細胞凋亡。Cotrina 等［8］研究發現，模擬缺氧缺血模型的腦片及細胞培養，Cx43 表達增多，GJ 功能增強導致細胞凋亡增加，腦損害加重。林潔英［9］在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷研究中也發現，缺氧缺血組皮質、海馬區域Cx43 表達量在各時相點均高出對照組，其變化規律與神經細胞凋亡、腦組織病理改變嚴重程度的時間窗吻合，且Cx43 發生變化開始時間早于細胞凋亡，提示星形膠質細胞Cx43 表達的增強可能參與了新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的病理形成過程。推測可能機制為表達增多的Cx43 及其GJ 迅速跨膜傳導代謝有害物質進入周邊細胞，加重半暗區的凋亡及病理惡化，導致腦損傷的加重。韓冬［10］通過應用RNA 干擾技術抑制星形膠質細胞Cx43 合成，進而減少縫隙連接半通道及通道形成，導致凋亡的細胞減少，說明抑制縫隙連接蛋白可以起到抗凋亡的作用。

近年來也有研究報道Cx43 在缺血再灌注中對大腦神經元起保護作用。有研究表明，過量表達的Cx43 本身可以保護膠質細胞免受損傷，而使用GJ 阻斷劑并沒有使這種作用消失;在急性腦缺血再灌注損傷時，吸入氫可提高Cx43 的表達水平，從而減少缺血再灌注對神經元的損傷［11］。Orellana等［12］把Cx43 作為治療缺血再灌注損傷的新靶點，實驗中發現阻斷Cx43 半通道表達可減少神經元的獨立生存能力，說明合理調控Cx43 的表達可預防大腦神經元缺血再灌注損傷。Michael［13］等發現Cx43 的C-末端在通道活性中扮演重要角色。相同程度的缺血應激后，敲除了C-末端的大鼠與對照組相比，腦損傷加重，缺血半暗帶擴大。提示Cx43 的C-末端在缺血性腦損傷中起重要的保護作用。

Cx43 在缺血預處理(ischemia preconditioning，IP)中也發揮重要作用。實驗發現IP 減少了由缺血再灌注誘發的心肌細胞膜和線粒體Cx43 的降解和脫磷酸化，維持了心肌細胞Cx43 mRNA 和細胞膜、線粒體蛋白Cx43 的表達水平，維持了縫隙連接的基本結構，從而有效地減少缺血再灌注對心肌的損傷［14］，同時可以通過激活PKC 激酶維持磷酸化Cx43 的水平，關閉縫隙連接通道，減少死亡因子的擴散來發揮縮小心肌梗死范圍的作用。IP 可通過開放線粒體敏感性鉀通道使心肌缺血時Cx43 磷酸化，抑制其內化。可通過上調Cx43mRNA 表達量，來減少缺血/再灌注引發細胞腫脹程度。由此可見，Cx43 在IP 的心肌保護作用中極為重要。但目前國內外缺乏GJ 在缺血預處理腦保護中作用的相關研究，此方向有待深入探索。

2.2 半通道與缺血性腦卒中 有研究報道，腦缺血使Cx43 去磷酸化誘導半通道開放，但Cx43 半通道開放量的增加與氧化作用和嵌入細胞膜的Cx43 半通道增多有關，與半通道Cx43 去磷酸化無關。

半通道開放可通過介導細胞凋亡使腦損傷加重［15］。最初發現半通道開放現象是在過表達Cx 46 的爪蟾卵母細胞上，如果不施加高Ca2+關閉此通道，這些卵母細胞很快就死亡。Orellana［16］發現促進Cx43 半通道的表達，可增加胞內儲存的Ca2+離子的釋放，說明Ca2+離子通道的活動度與Cx43半通道開放有關。通常認為，Ca2+穩態失衡被視為細胞死亡的最終通路。朱麗萍［17］研究發現缺血/缺氧情況下，Cx43 及Cx43 半通道的表達增加，縫隙連接及半通道的開放增多，增加了細胞間的偶聯程度，引起的Ca2+超載及Ca2+波擴散誘導了細胞調亡，使細胞死亡增多，梗死體積擴大。推測可能機制為:半通道開放數增大后，一方面可造成自身細胞的離子紊亂(細胞內Ca2+超載，K+減少)及代謝失衡(ATP、NAD+、谷氨酸大量釋放)，促進細胞死亡。另一方面釋放的ATP、NAD+等物質，通過旁分泌作用于臨近細胞刺激產生IP3 及環腺苷二磷酸核糖(Cyclic Adenosine Diphosphate Ribose，cADPr)，二者通過調節內質網Ca2+通道，使包漿內Ca2+急劇增加，同時，通過縫隙連接向周圍細胞進行傳遞，過高的Ca2+和IP3 則可引起星形膠質細胞及遠隔的神經元異常興奮，激活鈣依賴性的磷酸酶、蛋白酶、ATP 酶、核酸內切酶等，最終引起細胞死亡。

半通道與缺血后腦水腫也存在一定關系。半通道可通過調控細胞體積影響細胞對損傷的反應，機制為谷氨酸可通過縫隙連接半通道釋放到細胞外，而谷氨酸的大量釋放，能通過其受體發揮神經元興奮性毒性作用，引起或加重顱腦損傷后腦水腫。

研究發現，通過膜片鉗和生物熒光技術檢測出CX43 半通道可以通透ATP。Cx43 在缺血狀態下表達顯著增加，半通道開放相應增加，經其流出的ATP 迅速降解為阿糖胞苷，通過其A1 受體介導減輕缺血損傷;另外阿糖胞苷舒張血管作用也可對缺血半影區起很強的保護作用。因此半通道的通透性增加是保護還是加重細胞損傷目前尚不清楚。

2.3 GJ 與缺血性腦卒中 腦缺血情況下，Cx43 縫隙連接發生改變，同時縫隙連接細胞間通訊在組織損傷和細胞死亡過程中又具有雙重作用。

有學者發現，轉染胸苷激酶的細胞會死亡，而鄰近未轉染胸苷激酶的細胞也相繼出現死亡，推斷這種“旁觀者死亡效應”與GJ 密切相關。1996 年，States 等提出大鼠海馬區血供并不來自大腦中脈，但永久性大腦中動脈阻塞后，50%的動物出現海馬CA1區神經元不可逆損傷甚至死亡。有學者將大鼠大腦皮質星形膠質細胞分離純化后在體外空氣含糖環境中培養，待細胞融合后置于＜1%02飽和度的缺氧無糖環境中，觀察發現細胞間有染料耦聯。這些實驗證實，在缺血缺氧環境中星形膠質細胞處于開放狀態，具有介導細胞間通訊的功能，從而導致CA1區細胞死亡。

唐穎馨［18］利用MCAO 模型，選用縫隙連接阻斷劑甘珀酸來研究縫隙連接通訊后海馬遲發性神經元死亡的影響。結果表明，阻斷縫隙連接通訊可有效減小梗死面積及海馬區遲發性神經元死亡發生率。Frantseva 通過體外制備海馬區腦組織缺血模型，發現在缺血后48h 應用甘珀酸抑制細胞間GJ 可有效減少細胞死亡數，證明了腦缺血再灌注后神經元的損傷程度與星形膠質細胞GJ 的數量與密度呈正相關。在急性腦缺血時，一方面，GJ 使得周圍細胞間形成代謝耦聯，因而缺血中心的垂死細胞除引起自身死亡外，發出的凋亡信號可能通過星形膠質細胞傳遞到半暗帶區，從而啟動了半暗帶區細胞的凋亡程序;另一方面，由缺血中心區鉀離子和興奮性氨基酸釋放所引起的自發性梗死周圍去極化可能導致半暗帶區細胞損傷，而研究表明GJ 參與了梗死周圍去極化的形成;最后，在缺血情況下缺血中心區細胞內的ATP 迅速消耗，GJ 可能順濃度差將能量由半暗帶區送到中心區內垂死的細胞，導致更多的細胞因能量短缺而受損。因而認為抑制Cx43 可能通過抑制縫隙連接通訊從而發揮神經保護。

但既往也有研究證實，局部腦缺血事件后，Cx43 基因敲除鼠比對照組腦梗死面積明顯增加，細胞凋亡數目增大［19］。在體外混合培養的星形膠質細胞與神經元中，無GJ 耦聯的細胞對缺氧和谷氨酸毒性的耐受性比有GJ 耦聯的細胞明顯減弱，腦缺血后神經元的損害較嚴重。這些結果提示GJ 對缺血腦組織有潛在的保護作用。腦組織缺血缺氧損傷后，星形膠質細胞GJ 處于開放狀態，可介導細胞間通訊，及時清除有害物質Ca2+、谷氨酸等，保護腦組織，還可為為梗死區神經元提供ATP、糖類等營養物質，支持受損神經元，減慢腦損傷的擴散。

3 縫隙連接阻斷劑與缺血性腦卒中

缺血性卒中是人類致死的主要原因和成人致殘的首要原因。縫隙連接活動可加劇并參與腦缺血的損傷過程，縫隙連接阻斷劑能夠抑制縫隙連接胞間通訊，減輕缺血/再灌注對膠質細胞的損傷，同時對缺血區及遠隔區神經元起到了一定的保護作用，有效地減少梗死體積，這為缺血性卒中的治療提供了新的思路。

目前發現多種物質可以抑制縫隙連接。但研究多數以Cx43 本身的結構、生理功能、在電生理中的作用為主。作用靶點為連接蛋白的藥物較少，常見的有3 大類［20］:第一類為縫隙連接耦聯抑制劑，多為親脂性藥物，如庚醇、辛醇、甘珀酸、全反式維甲酸和油酸酰胺等，主要機制是通過摻入脂質雙分子層破壞縫隙連接的功能;第二類為縫隙連接耦聯激動劑，目前有抗心律失常肽一種;第三類為影響蛋白本身生理過程的藥物，如他汀類藥物，這類藥物通過不同途徑影響連接蛋白的合成、裝配、定位、降解，也是3 大類藥物中惟一一類正式進入臨床的藥物。但這些縫隙連接阻斷劑不僅在不同種屬和器官間存在較大差異，而且有的還存在較嚴重的副作用。因此，找到一種強效、特異和可逆的縫隙連接阻斷劑對于治療心、腦血管疾病是十分必要的。有學者發現利用Cx 細胞內、外結構的相對應的短肽序列可產生抗原表位的特異性抗體，能夠更有針對性的研究縫隙連接的結構及功能［21］。例如，Cx43 兩個胞外環中的短肽模擬物Gap26 及27已作為生物探針，特異性阻斷GJIC。有學者［22］利用有靶向功能的Cx43 C-末端合成短肽模擬物Gap19N，Gap19N 能夠與C-末端結合，阻斷了分子內C-末端的相互作用，針對性抑制細胞膜上的半通道，而不抑制GJ，這類肽模擬物可選擇性阻止半通道開放，通過降低半通道開放率減輕缺血性損傷，可作為缺血性心、腦系統疾病的一種研究方法。

4 展 望

綜上所述，星形膠質細胞GJ 與缺血性腦卒中的損傷程度確實相關。然而，星形膠質細胞GJ 究竟加重還是減弱了缺血性腦卒中的損傷，目前難以明確。闡明Cx 及其介導的縫隙連接的通訊功能及在腦缺血損傷與作用，有助于進一步理解膠質細胞參與腦缺血的病理機制。以縫隙連接蛋白作為新的設計靶點，有助于探索缺血性腦卒中的新型治療方法。

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