結核病耐藥性檢測技術進展及存在的問題和對策

胡忠義

·專家論壇·

結核病耐藥性檢測技術進展及存在的問題和對策

胡忠義

結核病耐藥性檢測技術研究取得了顯著進展,但仍不能滿足臨床診治及防控的需求。一些新的細菌學和分子生物學藥敏檢測技術盡管比傳統的耐藥性檢測方法更加快速和靈敏,但是各種新技術在臨床應用中也存在著不少問題。就這些新技術的優缺點及可能解決的措施和進展情況提出了一些看法,以便促進這些新技術的推廣和應用。

結核； 抗藥性,細菌； 微生物敏感性試驗

結核病耐藥性檢測技術研究雖然經過數十年的努力,取得了顯著進展,但仍不能滿足臨床診治的需要［1-2］。筆者就近年來的一些耐藥性測定新技術、新方法進展情況及其在應用中存在的問題和可能解決的方法提出一些看法,力圖促進這些新技術的推廣應用。

理想的耐藥性檢測新技術要求

理想的耐藥性檢測新技術應該達到以下四個基本要求。

1.快速：總體是越快越好。分子藥敏技術應該當天獲得結果,細菌學藥敏檢測希望在1周左右時間獲得結果。

2.準確：準確性越高越好。其中敏感度應該不低于90%,特異度應該在95%以上。

3.簡便：操作簡便,步驟少,減少人為因素影響,能夠自動化或半自動化更好。

4.價廉：價格低廉,便于基層民眾承受。

當前常用耐藥性測定方法存在的問題

一、細菌學耐藥性測定方法

1.固體藥敏培養法：絕對濃度法和比例法是目前國內外普遍應用的結核病耐藥性測定方法。其主要問題是：需時久,4周才能獲得結果；準確性低,與臨床符合率差；操作繁瑣,傳播風險大。

2.液體藥敏培養法：MGIT-960是國際公認的液體培養耐藥性檢測方法,具有快速、準確、儀器化檢測等優點,但需特殊儀器設備,試劑依賴進口,費用昂貴,限制了其在基層單位的應用。

二、分子藥敏檢測

分子藥敏檢測在我國尚處于研究階段,極少數單位開展臨床應用研究,其臨床意義難以定論。

耐藥性檢測新技術及其存在的問題

一、細菌學藥敏檢測技術及其存在的問題

1.細胞培養板藥敏檢測技術：該法在25孔細胞培養板上進行固體藥敏最小抑菌濃度（MIC）測定,7～10 d可獲得藥敏結果,具有簡便快速的優點［3］,但是由于含藥培養基用量少,分裝制備較為繁瑣,需依賴專用儀器設備,而且所用的MiddleBrook 7H10瓊脂培養基價格較貴,影響了其在基層的推廣應用。

2.液體微孔板MIC藥敏檢測：這種方法是在96孔塑料板上進行的微量液體藥敏試驗,7～10 d就可獲得10余種抗結核藥物的MIC測定結果。檢測結果表明,本法簡便快速,敏感度和特異度均可達90%左右,而且費用低廉,很受臨床歡迎［4-5］。存在的問題是液體培養基質量直接影響藥敏結果的時間,早期結果觀察存在主觀性,生物安全隱患較大。

3.顯微鏡觀察直接藥敏試驗：該法是將液體培養藥敏試驗與倒置顯微鏡觀察技術相結合的一種快速耐藥性檢測技術。由于 Mtb在液體培養基中生長時形成索狀結構,可以在倒置顯微鏡下觀察到。該法可同步進行痰標本的快速培養和藥敏檢測,7 d即可獲得診斷和藥敏結果,尤其是其藥敏檢測結果的準確性可達95%以上,深受臨床用戶歡迎［6-7］。存在的問題主要是液體培養基質量直接影響藥敏結果的時間和準確性,早期結果觀察時可能會出現人為因素的影響,質量控制較難。另外,每日鏡下觀察,生物安全隱患較大。

4.雙相羅氏培養基藥敏試驗：是一種將固體羅氏培養基和液體藥敏培養基結合為一的快速藥敏檢測技術,具有簡便、準確、價廉、不需特殊儀器設備等優點；其藥敏時間比常規羅氏藥敏時間縮短2周,藥敏結果與MGIT960的符合率達95%以上,而其成本僅為MGIT960的1/5,因此深受用戶喜愛［8］。但是藥敏早期結果肉眼不易觀察,需要通過加入顯色劑得以解決。

5.噬菌體擴增檢測技術：該法2～3 d即可獲得藥敏檢測結果,是目前最快的 Mtb表型藥敏檢測技術。具有準確、價廉、不需特殊儀器等優點［9-10］。除可用于臨床分離株的耐藥性檢測,也可用于涂陽痰標本的耐藥性測定。該法最顯著的優勢是生物安全性高,因其結果是將耐藥菌株裂解。這對實驗室生物安全和降低操作者被感染的風險具有重要意義。存在的問題是：操作步驟較多、容易污染和難以進行質量控制,這些都將影響其推廣應用。

二、耐藥性分子藥敏檢測新技術及其存在的問題

分子藥敏檢測技術近年來進展迅速,其最大優點是快速,通常1 d即可獲得藥敏結果,是WHO重點推薦的結核病快速藥敏檢測方法。

1.線性探針雜交藥敏檢測技術：將常見突變位點的寡核苷酸探針（R探針）和正常序列的探針（S探針）分別固定在硝酸纖維素膜上,與待檢菌株PCR擴增產物雜交。然后加入顯色系統,以呈色反應判定藥敏試驗結果。若擴增產物與S探針雜交陰性,與R探針雜交陽性,則待檢菌株為耐藥株,反之為敏感株。本法快速、靈敏、特異。已有產品上市,可同步檢測利福平和異煙肼的耐藥性。對比結果表明,本法對利福平耐藥株的陽性檢出率可達90%,對異煙肼耐藥株的檢出率達70%以上［11-12］。存在的問題是只能檢出常見的突變位點,而且對異煙肼的耐藥性檢出率還需提高。同時價格昂貴也是重要問題之一。

2.Xpert Mtb/RIF：該技術是利用RFP耐藥性相關基因rpoB特異性結合的分子信標（一種呈發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針）來檢測Mtb的rpoB基因上的利福平耐藥決定區有無突變。如果存在突變,則會影響分子信標與靶序列的雜交,使得熒光值下降,通過比較熒光信號的變化檢測利福平的耐藥性［13-14］。其最大優點是快速、靈敏,特異度高,但也存不少問題。最主要的是只能檢測RFP一種藥物的耐藥性,敏感度達90%左右。另外,需要特殊儀器設備,試劑費用也較貴,限制了其在基層的推廣應用。

3.基因芯片藥敏檢測技術：該法快速,從樣品制備到檢測結果只需4 h；靈敏,可以達微克、微微克水平。目前國內已開發的產品可同步進行Mtb和10多種常見非結核分枝桿菌的菌種鑒定,檢測 Mtb對4種一線抗結核藥物的耐藥性［15-16］。存在的問題是：只能檢出常見的突變類型,同時操作要求很高,儀器試劑較貴,限制了其廣泛應用。

4.測序：測序既能確定有無突變及突變部位和性質,因此是耐藥性測定的金標準方法。方法有Sanger DNA測序和焦磷酸測序技術。該方法對于操作技術要求較高,且受較多因素影響。值得一提的是焦磷酸測序技術,研究顯示：與常規藥敏方法比較,該法的敏感度為96.7%,特異度為97.3%［17-18］。該技術是依靠生物發光進行的實時DNA測序分析技術,其操作簡單、結果準確,且無需電泳和熒光標記,同時能提供精確的堿基序列信息。與Sanger法相比,焦磷酸測序技術測試速度快、成本低廉。由于該技術適用于對已知的較短DNA序列的測序分析,所以非常適合Mtb的耐藥性檢測。本法存在的主要問題是：操作繁瑣,條件要求嚴格,要測的耐藥基因種類很多,無效突變也被檢出,而且需要昂貴的儀器設備,費用較貴。

結核病耐藥性檢測技術展望

結核病耐藥性快速檢測研究雖然已取得了一些進展,但仍不能滿足臨床診治的需要。這主要與下述因素有關：首先是細菌藥敏檢測方法都是生長依賴性的,即只能對分離的菌株進行檢測,因而仍需較長時間；其次是藥敏結果的臨床含義即細菌學耐藥與臨床耐藥結果的一致性不確切；再者由于方法、原理及藥物濃度上的差異,各方法間缺乏良好的可比性。另外快速測定大多需特殊的儀器設備,且費用較貴,難以普及應用。再者分子生物學檢測方法在國內尚屬研究階段,許多問題還沒得到解決,因此短期內難以用于臨床。

一、當前結核病耐藥性檢測存在的主要問題

1.缺乏系統的方法學評價：雖然,目前報道的 Mtb耐藥檢測方法眾多,但能通過系統、科學的方法學評價的方法、且真正可用于臨床的方法仍然很少。

2.方法學之間的比較研究缺乏：各種方法學的符合度及綜合比較情況不清。

3.檢測藥物種類不全面：大多數耐藥性分子生物學檢測方法僅針對利福平和異煙肼少數藥物。

4.操作規范化和質量控制不夠：操作人員缺乏規范化培訓,水平參差不齊,實驗場地、儀器設備相距離很大,質量控制體系不健全。

5.與耐藥相關的基礎研究不夠深入：目前仍有許多藥物的耐藥機制不清,導致無法進行分子藥敏檢測。

6.缺乏耐藥檢測新技術的轉化：導致基礎研究成果不能及時進入臨床應用。

二、當前耐藥性測定亟待解決的問題

首先：科學評估已有測定技術,要做到科學、客觀、公平、公正,篩選出適合我國國情的耐藥性測定新技術,進而推廣應用。

第二：要加強現有藥物的抗結核作用篩查,尤其是進行廣譜抗生素的抗結核作用篩查,以便為抗結核治療提供依據。

第三：加強檢驗技能培訓和實驗場地建設。

第四：加強檢驗結果的質量控制工作,健全質控體系。

第五：研究新的耐藥性測定技術,包括細菌學、免疫學和分子生物學藥敏檢測技術,尤其是要開展RNA分子藥敏檢測技術研究,開展耐藥相關的新型分子靶標篩查,開展耐藥相關差異蛋白檢測,開展耐多藥相關的酶學檢測技術研究。

第六：促進已有研究成果的轉化,將研究成功的檢測新技術盡快試用于臨床。

第七：加強抗結核新藥的研究,包括西藥、中藥、化學合成藥物等。

近年來,盡管耐多藥結核病的實驗室診斷取得了一些進展,但是還存在許多問題應予重視。需要從事結核病基礎、臨床和防控人員緊密協作,聯手對存在的問題進行攻關。相信隨著檢測方法的先進性、試劑的標準化和操作的規范化,以及臨床意義界定等問題的逐步解決,結核病耐藥性的實驗室檢測技術必將取得更大進展！

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The progress and the existing problems and countermeasures of TB drug resistance testing technolog

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HU Zhong-yi. Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis,Shanghai Pulmonary Hospital,Tongji University School of Medicine,Shanghai 200433,China

HU Zhong-yi,Email：shtblab@163.com

TB drug resistance testing technology research has made significant progress,but still cannot meet the needs of clinical diagnosis and treatment,and prevention and control.Some new drug susceptibility testing technology including molecular biology and bacteriology is more rapid and sensitive than the traditional detection method,but all kinds of new tools have some problems in clinical application.In this review,the advantages and disadvantages of these new technologies are presented and the potential countermeasures and the advancements are put forward,so as to improve the promotion and application of the new technologies.

Tuberculosis； Drug resistance,bacterial； Microbial sensitivity tests

2013-09-05）

（本文編輯：薛愛華）

“十二五”國家科技重大專項（2013ZX10003001）,上海市科委重點項目（12DZ2271100）

200433上海,同濟大學附屬上海市肺科醫院上海市結核病（肺）重點實驗室

胡忠義,Email：shtblab@163.com