胰腺高級別上皮內瘤變及其miRNA的研究進展

塔娜 鄭建明

胰腺高級別上皮內瘤變及其miRNA的研究進展

塔娜 鄭建明

胰腺上皮內瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)是指胰腺中小導管上皮細胞從不典型增生至原位癌這一系列病變的連續過程，根據其組織學異型性可分為3期，其中PanIN-1、2期為低級別，PanIN-3期為高級別[1-3]。目前已經證實PanIN-3期是胰腺癌最直接的癌前病變[4]。如果能在該期作出診斷，及時進行干預和治療，是完全可以治愈胰腺癌的。因此尋找此期的特異性標志物是解決問題的關鍵。近年研究表明，miRNA不僅在腫瘤組織和細胞中的表達具有顯著的腫瘤相關性、組織特異性和表達穩定性[5]，而且在外周血中的表達同樣具有腫瘤相關性和組織特異性，與RNA比較，其表達穩定性更為顯著，因此認為外周血miRNA可能是一種理想的腫瘤分子標志物。同樣，胰液中miRNAs檢測也是早期診斷胰腺疾病的重要途徑[6]。因此，篩查和鑒定PanIN-3期組織和血或胰液中特異表達的miRNAs，探討其作為胰腺癌早期診斷分子標志物的潛在可能性，對于提高胰腺癌的早期診斷率，改善其預后具有非常重要的意義。

一、胰腺上皮內瘤變(PanIN)

1．PanIN的病理特征和命名：PanIN是一種顯微鏡下才能觀察到的胰腺中小導管上皮細胞出現的扁平或乳頭狀增生性病變，有一定程度異型性，屬于非侵襲性病變。人類早在一個多世紀之前就已觀察到此類病變，但由于缺乏統一的分類標準和命名，使用的術語各不相同。為了探討胰腺導管病變新分級系統的科學性，1999年世界胰腺癌研究組將35例具有代表性的胰腺導管病變HE切片分別送給8位來自美國、加拿大和歐洲的病理學家，結果幾乎每一例病理診斷都存在較大差異。為尋求統一，在后來的研討會上病理學家們同意采用Klimstra和Longnecker等提出的“胰腺上皮內腫瘤”這一新概念和分級標準[7]。對照此標準，8位病理學家再一次復習原來的35例切片，并重新進行診斷，結果只有7例出現分歧，這一結果充分顯示出新分級系統的科學性和實用性。在2003年召開的胰腺癌前病變會議就PanIN的組織學診斷和分級標準達成了國際共識[8]。

2．PanIN的臨床特征：PanIN是只有在顯微鏡下才能觀察到的病變，因此臨床上是無癥狀的。PanIN可發生于各種胰腺病變中，甚至在正常胰腺組織中亦可出現，特別是低級別PanIN。但在慢性胰腺炎、胰腺導管內乳頭狀腫瘤、黏液性囊腺瘤和胰腺導管腺癌等病變中出現的頻率較正常胰腺組織和其他胰腺良性病變中要高，特別是胰腺導管腺癌中，出現高級別PanIN的可能性要明顯高于胰腺良性病變[9]。Andea等[10]研究顯示，在慢性胰腺炎特別是胰腺癌癌周組織中經常可以見到胰腺上皮內腫瘤性病變，隨訪結果也顯示PanIN，特別是高級別PanIN與胰腺癌的發生密切相關。筆者對250例不同胰腺組織中PanIN的發生率和分級進行了研究，結果顯示PanIN的發生率為62.4%，從正常胰腺到慢性胰腺炎到胰腺導管腺癌組織中PanIN的發生率逐漸增加，尤其是高級別PanIN更為顯著，PanIN-3期僅見于導管腺癌中[11]。

3．PanIN的分子遺傳學改變：研究顯示，隨著PanIN級別的升高，構成其細胞的突變率隨之增高，二者呈平行關系，高級別PanIN遺傳學改變也在浸潤癌中出現。Swaitz等[12]對PanIN和浸潤癌進行黏蛋白4表達研究，發現浸潤癌恒定表達黏蛋白4，而PanIN隨著級別增加，黏蛋白4表達也隨之增強。還有人對胰腺癌和PanIN的p53和DPC4基因進行研究，發現高級別PanIN和胰腺癌一樣存在等位基因缺失。Feldmann等[13]通過檢測正常胰腺導管和各級別PanIN性病變的基因改變，將胰腺癌的組織學進展與分子遺傳學改變聯系了起來。該模型顯示從正常胰腺導管上皮發展到PanIN-3期伴有多種基因的改變和染色體的異常，早期有K-ras基因和Her-2/neu基因突變，中期有p16基因失活和染色體9p的雜合性缺失，而晚期則有p53、DPC4和BRCA2基因的異常和染色體6q、17p和18q的雜合性缺失。此外，目前PanIN中涉及的分子遺傳學改變還包括端粒酶、黏蛋白、BRCA2基因、炎性細胞因子、miRNA和表觀遺傳學的改變等[14]。筆者通過建立PanIN和胰腺癌的組織芯片，對比研究了細胞增殖周期中多種相關基因改變和蛋白的表達，結果也顯示出正常導管-低級別PanIN-高級別PanIN的演變過程[15]。

4．PanIN的動物模型：為了更好地研究PanIN發生、發展規律，探索胰腺癌早期診斷和有效治療方法，最早的研究者采用化學誘導方法建立胰腺癌動物模型，如用亞硝胺類化合物或用偶氮絲氨酸誘導方法。此類模型的特點是制備方法簡單、方便，但周期長，誘導成功率低，且誘導產生的腫瘤其病理形態學特征與人類腫瘤差別很大。后來人們通過接種在動物體內建立了人胰腺癌皮下或原位移植瘤模型，但這些模型只能用于特定的研究目的，如藥物篩選或轉移機制研究等。近年來，轉基因動物模型的建立為獲取胰腺癌早期病變樣本提供了一條新途徑[16]。Hingorani等[17]通過轉基因小鼠成功進行了胰腺癌早期病變的造模，為早期胰腺癌標志物研究所需樣本提供了來源。在該模型中，腫瘤穩定發生，研究者可以根據研究需要，獲取不同階段的腫瘤樣本，已成為最經典的胰腺癌轉基因小鼠模型。Ijichi等[18]建立的腫瘤模型的病理特征非常接近于人類胰腺導管腺癌(PDAC)。該模型PanIN的發生率更高，耗時更短，為開展PanIN-3期和早期胰腺癌分子標志物篩選創造了條件。Thayer等[19]建立的Pdx1-Cre-CLEG2-K-rasG12D模型更加接近于人類胰腺癌。此類采用“轉基因可誘導表達系統”以K-ras轉基因小鼠為基礎誘導的多基因聯合作用的轉基因小鼠模型可成功誘導PanIN的發生，復制出人類胰腺癌的發生、發展過程，為胰腺癌的發病機制研究開辟了新途徑。

二、胰腺上皮內瘤變中miRNA

miRNA是一種內源性非編碼單鏈小分子RNA，長度19～24個核苷酸，通過與mRNA特定區域結合對蛋白質的翻譯進行調控，在多種生物學過程中發揮重要作用。目前已報道1000多種人類miRNA，其中一部分miRNA在細胞增殖、凋亡和分化中發揮作用。多種腫瘤及癌前病變中存在miRNA表達譜的改變。

1．動物模型PanIN中miRNA研究進展：du Rieu等[20]研究了29例K-ras(G12D)突變小鼠胰腺腺管PanIN組織，發現miR-21、miR-205和miR-200在小鼠PanIN組織中表達增高，并用原位分子雜交技術證明在胰腺非典型增生的導管上皮細胞中miR-21的表達增高。LaConti等[21]通過建立基因工程胰腺癌小鼠模型(p48-Cre/LSL-KrasG12D)獲取各級別PanINs進行差異miRNAs篩選。結果顯示，與正常導管上皮相比，隨PanIN級別升高而表達升高的miRNAs有miR-10、miR-16、miR-21、miR-100、miR-155，它們在高級別PanIN和癌組織中維持高表達，而降低的有miR-22、miR-148a/b、miR-212和miR-375。該研究還對這些差異表達的miRNA的靶基因進行了分析。Hanoun等[22]也在基因敲除小鼠LSL-KrasG12D/Pdx1-Cre+/-PanIN-1B、PanIN-2和PanIN-3中發現miR-148a明顯下調，其原因是由于編碼miR-148a的DNA甲基化所致。

2．人體組織PanIN中miRNA研究進展：Szafranska等[23]研究顯示，60%的PanIN-3期中表達miR-196a，而PanIN-1期中不表達，提示miR-196a與胰腺癌發展有關。du Rieu等[20]通過顯微切割方法獲取人和胰腺癌小鼠PanIN組織，采用實時熒光定量PCR方法檢測7種成熟miRNAs在PanIN中的表達，結果顯示，miR-21隨PanIN分級增加而上升，認為miR-21可作為胰腺癌早期診斷的分子標志物。但該研究沒有篩查PanIN-3期存在的特異性miRNAs。Ryu等[24]分析了miR-21、miR-155和miR-221在胰腺PanIN-1、PanIN-2和PanlN-3期中的表達，結果顯示miR-155在PanIN-2期表達上調，miR-21在PanlN-3期表達上調，提示miR-155表達異常出現在胰腺導管腺癌的較早期階段，miR-155可作為胰腺癌前病變的生物學標記物。Yu等[25]采用激光顯微切割方法獲取人胰腺組織中的各級別PanIN病變和正常導管上皮，通過miRNA芯片篩查，鑒別出各級別PanINs中有107種miRNA存在異常表達，PanIN-3期中有35種表達異常，其中表達明顯上調或下調(超過5倍以上)的miRNAs分別有20余種和10余種，上調表達的miRNAs有miR-106b-5p、miR-31-5p、miR-142、miR-101-3p、miR-29、miR-17-5p、miR-200b-3p、miR-195-5p、let-7g-5p、miR-93-5p、miR-21、miR-513b、miR-155、miR-4778-3p、miR-376a-5p、miR-3175、miR-146-5p、let-7a-5p、miR-1290、miR-34a-3p、miR-548a、miR-126-3p等；下調表達的miRNAs有miR-15a-5p、miR-125-3p3、miR-29c-3p、miR-16-5p、miR-218-3p、miR-127-3p7、miR-3122、miR-548、miR-126-3p、miR-3175、miR-217、miR-26a-5p、miR-150、miR-154-5p等；miR-196b是PanIN-3中特有的，認為它可以作為PanIN-3期診斷的分子標志物。

三、展望

miRNA在組織中不易降解，能夠穩定地存在，且能夠游離于細胞外，穩定存在于血漿或血清，具備疾病分子生物學標志物的特點，已在腫瘤診斷和預后評估中顯示了獨特的應用價值。但miRNA作為早期胰腺癌標志物的研究仍存在諸多問題，如通常在小樣本研究中得到的PanIN相關miRNA表達譜能否作為生物學標志物尚需在大樣本研究中得以驗證；miRNA在胰腺癌發生及進展過程中發揮作用的分子機制尚有待進一步闡明；miRNA異常表達在胰腺癌發生、發展過程中出現和癌變的時間尚需進一步確定等。相信隨著研究的不斷深入和上述問題的闡明，將有助于加快miRNA作為早期胰腺癌，尤其是PanIN-3期生物學標志物由實驗研究向臨床應用轉化的進程，為胰腺癌的早期診斷、預后評估和治療提供新的分子靶標。

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2013-08-20)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.024

國家自然科學基金面上項目(81172077)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院病理科

鄭建明，Email: jmzheng1962@163.com