正常與乳腺腫瘤細胞表面黏附分子CD44活化狀態差異分析

侯利丹，劉鹥雯，何怡青，楊翠霞，杜 艷，高 鋒

(上海交通大學附屬第六人民醫院中心實驗室，上海200233)

CD44是一種廣泛分布于細胞表面的跨膜糖蛋白受體［1-2］。其配體透明質酸(HA)是一種由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸為結構單元的高分子黏多糖，是細胞外基質的主要組成部分。據報道，CD44與HA結合，可介導細胞與細胞外基質黏附、淋巴細胞歸巢等多種生理和病理過程［3-4］。許多腫瘤細胞表面CD44高度表達，其在腫瘤的侵襲和轉移過程中發揮重要作用。目前，已有許多學者以CD44為靶點分子，通過阻斷CD44-HA結合從而降低腫瘤轉移，進行腫瘤的靶向治療。Zawadzki等［5］運用 CD44s受體蛋白、CD44v10受體蛋白和CD44單克隆抗體阻斷小鼠B16F10黑色素瘤CD44與其配體HA結合，發現在不進行任何其他處理的情況下，CD44s受體蛋白和CD44v10受體蛋白可使腫瘤在肺部的轉移量分別降低70%和60%，CD44單克隆抗體也取得了基本相同的效果。近年來，隨著納米載藥系統研究的興起，納米顆粒連接靶向分子HA，針對腫瘤細胞表面CD44進行腫瘤靶向治療取得很大進展。Auzenne等［6］發現 HA-PTX納米顆粒對CD44陽性人卵巢癌細胞SKOV-3ip和NMP-1的殺傷活性明顯大于單純PTX，加入過量游離的HA能夠阻斷這種增強的殺傷活性，提示HA-PTX通過靶向細胞表面CD44，達到增強殺傷細胞的效果。

雖然許多學者成功以CD44為靶點，HA為靶向分子，靶向殺傷腫瘤，提高藥物療效［7-8］。但是，關于以CD44為靶點靶向殺傷腫瘤細胞的同時，是否會靶向殺傷高表達CD44的正常細胞這一問題，少有報道。研究顯示CD44與HA的結合并不完全是自發的，不同活化狀態的CD44與HA的結合活性不同，與 CD44糖基化［9］、細胞類型［10］和 HA 自身狀態［11］等因素相關。許多腫瘤細胞如乳腺癌細胞、肺癌細胞表面CD44處于活化狀態，不需要任何刺激因素即能自發結合HA［12］。正常細胞表面CD44處于何種狀態，是否存在上述調控，目前仍未闡明。我們通過檢測CD44與其天然配體HA的結合活性，探討正常細胞和乳腺腫瘤細胞表面CD44的活化狀態是否存在差異，旨在深入分析以HA為靶向分子，CD44為靶點進行腫瘤靶向治療的可行性，明確HA是否選擇性靶向腫瘤細胞表面CD44，而不靶向同樣高表達CD44的正常細胞。

材料和方法

一、細胞

乳腺腫瘤細胞Hs578T、BT-549，正常小鼠胚細胞NIH3T3均購自中國科學院典型培養物保藏中心;分離20名正常人肝素鈉抗凝血獲取其外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。

二、主要試劑

RPMI1640培養液、DMEM培養液均購自GIBCO公司，淋巴細胞分離液購自上海華精生物高科技有限公司，PE標記的鼠抗人CD44單克隆抗體，PE標記的鼠抗人CD44同型對照抗體均購自eBioscience公司，PE/Cy5標記的鼠CD44單克隆抗體購自Abcam公司，熒光標記的透明質酸(FL-HA)購自Calbiochem公司。

三、細胞培養

將Hs578T細胞在DMEM培養液(含10%胎牛血清、0.01 mg/mL牛胰島素)中常規培養;BT-549細胞在RPMI1640培養液(含10%胎牛血清、0.023 U/mL牛胰島素)中常規培養;NIH3T3細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養液中培養。培養條件均為5%CO2、37℃，飽和濕度。所有實驗細胞均取自對數生長期。

四、Ficoll法分離人外周血單個核細胞

取正常人肝素鈉抗凝血4 mL，加入等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)充分混勻，將其緩慢加入適量淋巴細胞分離液中，800×g水平離心15 min，小心吸取白膜層，用PBS 400×g離心10 min洗滌2遍，即獲取人外周PBMCs。

五、流式細胞術鑒定細胞表面CD44的表達

分別取肝素鈉抗凝血100 μL，加入2個流式專用管中，實驗組加入適量CD44-PE單克隆抗體，陰性對照加入等體積CD44-PE同型對照抗體，輕輕混勻，室溫避光孵育15～30 min后，在QPREP免疫學樣品制備儀(COULTER公司生產)上處理血標本，流式細胞儀分析結果。0.25%胰酶分別消化處于對數生長期的NIH3T3細胞、Hs578T細胞和BT-549細胞，顯微鏡下觀察。細胞呈單細胞懸液時用含血清的培養液終止消化，200×g離心5min，棄上清，再用適量PBS洗滌2遍計數，所有細胞均按每管約106個細胞的比例，收集至2個Eppendorf管中。NIH3T3細胞實驗組加入適量鼠CD44單克隆抗體，乳腺腫瘤細胞實驗組加入適量鼠抗人CD44單克隆抗體，對照組加入等體積CD44同型對照抗體，室溫避光放置15～30 min，PBS 洗滌2 遍，500 μL PBS 重懸，移至流式管中上機檢測，收集10 000個細胞，熒光強度以對數放大，結果用CD44細胞的陽性率表示，數據用軟件進行分析。

六、流式細胞術檢測細胞表面CD44的活化狀態

用Ficoll法分離獲取2管人外周PBMCs，每管細胞數量約在106左右。0.25%胰酶分別消化處于對數生長期的小鼠胚細胞NIH3T3和乳腺腫瘤細胞Hs578T、BT-549，顯微鏡下觀察。細胞呈單細胞懸液時用含血清的培養液終止消化，200×g，離心5 min，棄上清，再用適量PBS洗滌2遍，PBS重懸后計數，所有細胞均按比例收集于2個Eppendorf管中，每管約106個細胞。每種細胞均分為實驗管和對照管，實驗管加入40 μg/mL FL-HA 100 μL 重懸，對照管加入100 μL 培養液，37℃避光孵育2 h。然后用PBS洗滌2遍，移至流式管中，上機檢測。

七、細胞免疫熒光法觀察FL-HA與細胞表面CD44的靶向結合作用

分別收集對數生長期的小鼠胚細胞NIH3T3和人乳腺腫瘤細胞 Hs578T、BT-549，消化至單細胞呈單個懸液，接種到24孔培養板中，培養24～48 h，隨機分為實驗組和對照組，每組設雙復孔，實驗組加入 40 μg/mL FL-HA 200 μL，對照組加入200 μL培養液，37℃避光孵育1 h，PBS洗滌2遍，熒光顯微鏡下觀察。

八、統計學方法

結 果

一、正常細胞與腫瘤細胞表面CD44的表達

正常人 PBMCs、NIH3T3細胞及 Hs578T細胞、BT-549細胞均高表達CD44，見圖1。CD44細胞的陽性率分別為(99.57±0.31)%、(99.26±0.81)%、(99.85±0.21)% 和(99.99±0.10)%，各組間CD44表達差異無統計學意義(P ＞0.05)。

二、正常細胞與腫瘤細胞表面CD44的活化狀態

正常人 PBMCs、NIH3T3細胞表面 CD44與HA結合活性較低;乳腺腫瘤細胞Hs578T、BT-549表面CD44與HA結合活性較高，CD44處于活化狀態，見圖2。CD44活化陽性率分別為(3.61±2.65)%、(14.33±1.35)%、(93.4±6.40)% 和(94.70 ±0.15)%，PBMCs、NIH3T3細胞與乳腺腫瘤細胞Hs578T、BT-549表面CD44活化差異有統計學意義(P＜0.05)，提示上述正常細胞表面CD44處于相對靜止狀態，乳腺腫瘤細胞表面CD44處于活化狀態。

圖1 流式細胞術檢測細胞表面CD44的表達

圖2 流式細胞術檢測細胞表面CD44的活化

三、FL-HA與細胞表面CD44的靶向結合

在熒光顯微鏡下觀察可見，與FL-HA孵育后，NIH3T3細胞與對照組熒光強度無明顯差異，表明FL-HA基本不與細胞表面CD44結合，無靶向作用，CD44處于相對靜止狀態;而乳腺腫瘤細胞Hs578T、BT-549與對照組相比，細胞表面發呈現出強綠色熒光，提示FL-HA與腫瘤細胞表面CD44高度靶向結合，CD44處于活化狀態，見圖3。

圖3 細胞免疫熒光觀察FL-HA與細胞表面CD44結合活性

討 論

近年研究發現，黏附分子CD44在許多惡性腫瘤細胞表面高度表達，如乳腺癌、結腸癌等。其與腫瘤的侵襲和轉移密切相關，特別是與天然配體HA的結合在腫瘤惡性進展中的作用受到廣泛關注［13］。目前已有學者運用HA、CD44單克隆抗體、CD44受體蛋白等阻斷CD44與HA的結合，有效減小腫瘤體積，抑制腫瘤轉移;以HA為靶向分子制作的藥物通過結合靶點CD44有效地提高了藥物在腫瘤部位的聚集，增加藥物的生物利用度，達到靶向治療腫瘤的效果。盡管許多學者已將腫瘤細胞表面高表達的CD44作為靶點進行腫瘤靶向治療研究，但在HA-化療藥靶向結合腫瘤細胞表面CD44，提高藥物對腫瘤細胞的殺傷效果的同時，機體許多正常細胞同樣高表達CD44，是否能夠免受靶向藥物的殺傷，及其如何免受其殺傷的機制，目前少有研究。

本研究分析了正常人PBMCs、NIH3T3細胞和乳腺腫瘤細胞Hs578T、BT-549表面的CD44表達及其活化狀態——即其與HA的結合活性。首先采用流式細胞術檢測上述正常和腫瘤細胞表面CD44的表達水平，結果顯示正常人 PBMCs、NIH3T3細胞和乳腺腫瘤細胞Hs578T、BT-549均高表達CD44，陽性率在95%以上，驗證了在正常細胞和腫瘤細胞表面CD44均存在高表達的現象。在此基礎上，應用FL-HA通過流式細胞術檢測CD44與HA的結合活性。結果顯示正常人PBMCs、NIH3T3細胞表面CD44與HA結合的活性較低，分別為(3.61±2.65)%和(14.33±1.35)%;乳腺腫瘤細胞表面CD44與HA的結合活性遠遠高于正常人PBMCs和NIH3T3細胞，均高于90%。正常與腫瘤細胞表面CD44與HA的結合活性存在相對差異。

本研究進一步闡明了正常細胞和腫瘤細胞表面CD44的活化狀態差異影響HA與其靶向結合的能力。NIH3T3細胞中加入FL-HA孵育后，熒光顯微鏡下觀察顯示NIH3T3基本無熒光，提示CD44處于相對靜止狀態，FL-HA與其靶向結合很弱。而腫瘤細胞表面呈現強綠色熒光，提示乳腺腫瘤細胞表面CD44處于活化狀態，FL-HA與其有很強的靶向結合活性。這一現象說明以HA為靶向分子，以CD44為靶點制備抗腫瘤藥物，藥物能夠選擇性靶向高表達CD44的腫瘤細胞，有效提高藥物對腫瘤的殺傷作用，但同樣高表達CD44的正常細胞，由于CD44處于相對靜止狀態，與HA結合活性較低，藥物對其無靶向及殺傷作用。這一結果提示，HA在靶向殺傷高表達CD44的腫瘤細胞時，機體高表達CD44的正常組織可以免受其殺傷。

綜上所述，本研究初步發現了CD44分布于正常和腫瘤細胞上的活化狀態不同。以HA為靶向分子、CD44為靶點進行腫瘤靶向治療時，能夠特異殺傷腫瘤細胞，有效避免靶向殺傷高表達CD44的正常細胞，為以CD44為靶點進行的腫瘤靶向治療研究提供了新的依據。但本研究對CD44活化狀態的研究尚處于初級階段，所用細胞局限為乳腺腫瘤細胞，其他腫瘤尚未涉及，有待進一步探索。另外，有關正常與腫瘤細胞表面不同活化狀態CD44的產生機制及其生物學意義，仍需進一步深入研究。

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