ICU產ESBLs大腸埃希菌氨基糖苷類修飾酶基因的分析

芮球紅，廖于峰，陳燕敏

(寧波市第二醫(yī)院檢驗科，浙江寧波315010)

大腸埃希菌是臨床常見的條件致病菌，也是重癥監(jiān)護病房(ICU)感染的主要病原菌之一。近年來，隨著抗生素的廣泛使用，產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌日益增多。ESBLs由質粒介導，易在種屬甚至不同種屬細菌間傳遞造成暴發(fā)流行［1］。這一現象已成為醫(yī)院感染的突出問題。氨基糖苷類抗菌藥物(aminoglycosides，AGs)是一種治療革蘭陰性菌感染的重要抗菌藥物。細菌對該類藥物耐藥主要是通過產氨基糖苷類修飾酶(AMEs)。我們收集了ICU分離的82株大腸埃希菌，通過ESBLs檢測、體外藥敏試驗和AMEs基因攜帶情況分析，了解ICU大腸埃希菌產ESBLs感染發(fā)生率，探討產ESBLs株AGs耐藥和AMEs基因之間的關系，以期為臨床合理選用抗菌藥物提供理論依據。

一、材料和方法

1.菌株來源 82株大腸埃希菌臨床分離株(不含同一病例相同部位的重復分離株)來自寧波市第二醫(yī)院2011年1月至2012年7月期間ICU住院患者，其中痰標本20份、尿標本26份、分泌物標本21份、膿液標本11份、靜脈導管標本4份。藥敏質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922(購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心)。

2.儀器與試劑 VITEK全自動微生物分析系統(tǒng)、M-H瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基購自法國 BioMerieux公司;藥敏紙片購自英國 Oxoid公司;5418型低溫離心機為Eppendorf公司產品;Power-PAC3000型電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產品;聚合酶鏈反應(PCR)試劑購自大連寶生物公司。

3.ESBLs表型確證試驗［2］參照美國臨床實驗室標準委員會(NCCLS)推薦的紙片確證擴散法標準進行，將頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸紙片貼在涂有待測菌的培養(yǎng)基上孵育，對2組中任何一個藥物加與不加克拉維酸的抑菌圈直徑差值≥5 mm時，可確證該菌株產ESBLs。

4.體外藥物敏感試驗 采用Kirby-Bauer紙片擴散法測定82株大腸埃希菌對6種AGs的敏感性。藥敏結果均按照2011年美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)標準判定。

5.PCR檢測產ESBLs大腸埃希菌AMEs基因 PCR擴增模板制備:挑純培養(yǎng)菌落少許置入0.5 mL離心管內，加入200 μL雙蒸水，置100℃水浴10 min，12 000×g低溫離心30 s。上清液即為基因檢測的模板液。-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ镌O計根據 aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ⅰ、aac(6’)-Ⅱ、ant(2")-Ⅰ和 ant(3")-Ⅰ基因序列并參照文獻［3］，由大連TakaRa公司合成，見表1。內參照基因為GAPDH［5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’(sense)，5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(antisense)］;擴 增 產 物 長 度 為452 bp。PCR 擴增體系:10×PCR Buffer 2.5 μL;2.5 mmol/L dNT 2.5 μL;上、下游引物(10 μmol/L)各 1.0 μL;HS Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL;dH2O 16.8 μL;DNA(50 mg/L)2.0 μL;總體積為25.0 μL。反應條件:95℃預變性5 min;95℃變性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s，共35 個循環(huán);最后 72℃延伸5 min。取 PCR擴增產物10 μL進行3%瓊脂糖凝膠電泳。

6.統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

二、結果

1.產ESBLs大腸埃希菌檢測結果 82株大腸埃希菌中檢出產ESBLs菌株43株，檢出率為52.4%。

2.產ESBLs菌株對AGs的耐藥特點 43株產ESBLs菌株有40株(90.7%)對AGs耐藥。產ESBLs和不產ESBLs菌株對6種AGs的耐藥率見表2。慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素和妥布霉素的耐藥率在產ESBLs和不產ESBLs菌株之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3.產ESBLs菌株大腸埃希菌AMEs基因攜帶情況 43株產ESBLs菌株中AMEs基因攜帶率為88.37%(38/43)，以 acc(3)-Ⅱ(79.07%)和 aac(6’)-Ⅰ(39.5%)為主，未檢出 aac(6’)-Ⅱ基因。產ESBLs菌株的acc(3)-Ⅱ和aac(6’)-Ⅰ基因陽性率明顯高于不產ESBLs菌株(P＜0.05)。見表3。

表1 氨基糖苷類修飾酶基因引物序列

表2 產ESBLs與不產ESBLs大腸埃希菌AGs耐藥情況比較［例(%)］

表3 產ESBLs與非產ESBLs大腸埃希菌AMEs基因攜帶率比較［例(%)］

三、討論

ESBLs是一種絲氨酸酶衍生物，主要由腸桿菌科細菌產生，以肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌為代表。ESBLs基因由質粒介導，可通過結合、轉化和轉導等形式進行耐藥性的傳播和擴散。因此，產ESBLs大腸埃希菌引起的耐藥問題給臨床治療帶來極大困難。本研究發(fā)現ICU大腸埃希菌ESBLs檢出率為52.4%，略高于文獻［4］報道。表明產ESBLs大腸埃希菌在本地區(qū)ICU流行嚴重，應引起足夠的重視。

AGs因其抗菌譜廣、療效卓越在治療革蘭氏陰性桿菌感染中得到廣泛的應用。近年來，由于抗生素泛用和過度治療，其耐藥性日趨嚴重。特別是產ESBLs大腸埃希菌對β-內酰胺酶類嚴重耐藥的同時，對AGs耐藥性也明顯升高。本研究表明，本地區(qū)約90%的產ESBLs大腸埃希菌對AGs耐藥，其中慶大霉素和鏈霉素的耐藥率約70%左右，而阿米卡星和奈替米星的耐藥率僅為10.7%左右。這可能與AGs的使用頻率、種類和ESBLs的基因型相關［5］。另外，與不產 ESBLs大腸埃希菌相比，產ESBLs株慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素和妥布霉素耐藥率明顯增加(P＞0.05)。上述結果提示，本地區(qū)ICU醫(yī)生不能經驗性的把AGs作為產ESBLs大腸埃希菌感染的治療藥物，必須嚴格按照體外藥敏結果來選用藥物。

大腸埃希菌對AGs耐藥的分子機制主要包括［6］:(1)藥物作用靶位的改變;(2)細菌細胞膜通透性改變，使進入胞內的抗菌藥物減少;(3)產生AMEs;(4)細菌產生16SrRNA甲基化酶;(5)細菌通過主動外排機制將已進入胞內的藥物泵至胞外。其中產生AMEs為主要原因。AMEs共價修飾抗菌藥物的氨基或羧基導致其結構變化，從而喪失與靶點結合的能力。AMEs主要有N-乙酰轉移酶(N-acetyltransferases，AAC)、O-核苷轉移酶(O-nucleotidyltransferase，ANT)和 O-磷酸轉移酶(O-phosphotransferases，APH)。目前研究較多的主要是AAC和ANT。本研究通過PCR檢測發(fā)現，產 ESBLs菌株 AMEs基因攜帶率高達88.37%。6種 AMEs基因中居前2位的是 acc(3)-Ⅱ(79.07%)和 aac(6’)-Ⅰ(39.5%)。本研究結果與黃永茂等［5］報道類似，但羅建華［7］等報道產 ESBLs菌株 aac(3)-Ⅱ基因陽性率高達94.1%。原因可能是耐藥細菌質粒介導的產ESBLs菌株具有區(qū)域特征性，不同區(qū)域有著不同的耐藥基因特征。另外，本研究還發(fā)現產ESBLs菌株acc(3)-Ⅱ和aac(6’)-Ⅰ基因陽性率明顯高于不產ESBLs菌株。這與產ESBLs菌株AGs耐藥率高于不產ESBLs菌株相一致。腸桿科細菌酶基因常位于攜帶ESBLs基因的質粒或轉座子上［8］。ESBLs以 SHV和 CTX-M 為主要基因型。Karisik等［9］發(fā)現攜帶CTX-M-15基因型的大腸埃希菌的質粒上同時攜帶acc(3)-Ⅱ和aac(6’)-Ⅰ。因此，本研究推測造成產與不產ESBLs菌株AMEs基因攜帶率差異的原因可能為產ESBLs基因的質粒或轉座子同時攜帶一個或多個AMEs基因，質粒的轉移和轉座子的轉座作用都有利于耐藥基因由耐藥菌向敏感菌傳播，導致多重耐藥。

總之，本地區(qū)產ESBLs大腸埃希菌對AGs耐藥性日趨嚴重，其機制可能為攜帶產ESBLs基因的質粒同時攜帶AMEs基因。因此，深入了解質粒介導的耐藥機制對研制新的有效的抗菌藥物非常必要。

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