佛波酯誘導血小板黏附受體GPⅠbα酶切的機制研究

王志成，羅梅宏，謝如鋒，張曉峰

(1.上海中醫藥大學附屬市中醫醫院實驗中心，上海200071;2.上海市血液中心血液工程室，上海200051)

血小板在活化的同時，伴隨有黏附受體GPⅠbα的酶切，產生的酶切片段稱為糖盞蛋白(glycocalicin，GC)［1］。GPⅠbα 酶切是血小板儲存損傷(platelet storage lesion，PSL)一個重要的生物標志物［2］。因此，闡明GPⅠbα酶切的機制將有助于認識血小板儲存損傷的機理。

佛波酯 (phorbol12-myristate-13-acetate，PMA)是常用的蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)的活化劑。PMA 能誘導 GPⅠbα 酶切［3］，但是PMA誘導GPⅠbα酶切的分子機制尚未完全闡明。我們主要探討了PMA誘導GPⅠbα酶切的分子機制。

材料和方法

一、材料

1.研究對象 選取健康志愿者10名，男、女各5名，經上海中醫藥大學附屬市中醫醫院倫理審查委員會批準同意，志愿者均簽署知情同意書。

2.主要試劑 抗GPⅠbα N端單克隆抗體SZ-2、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG二抗購自Santa Cruz公司;GM6001購自Calbiochem公司;二硫蘇糖醇(DTT)、NAD(P)H氧化酶抑制劑(DPI)、蛋白激酶 C(PKC)抑制劑(BIM)、佛波酯(PMA)、ROS檢測探針DCFDA購自Sigma公司;PKC活性檢測試劑盒購自Promega公司;線粒體活化氧(ROS)拮抗劑MitoQ購自蘇州沃盛化學有限公司。

二、方法

1.制備洗滌血小板 取健康自愿者靜脈血，用檸檬酸鹽緩沖液(ACD)按照1∶7抗凝，380×g離心20 min得到富含血小板血漿(PRP)，PRP經1 500×g離心20 min，沉淀用葡萄糖檸檬酸鹽緩沖液(CGS)緩沖液懸浮，經離心、洗滌，最后用MTB液重懸，得到洗滌血小板，調整血小板濃度為3×108/mL，室溫靜置1 h使其恢復至靜息狀態以備用［4］。

2.Western blot檢測 GPⅠbα酶切片段 3×108個/mL洗滌血小板與1.0 μmol/L PMA或二甲基亞礬(DMSO)37℃孵育30 min，2 600×g離心5 min，得到上清，加入5×上樣緩沖液和β-巰基乙醇，最后樣品經western blot檢測GPⅠbα酶切片段。抑制實驗:3×108個/mL洗滌血小板預先與100 μmol/L BIM、DTT(25、50、100、200 μmol/L)或DMSO 37℃孵育15 min后，再與1.0 μmol/L PMA 37℃孵育30 min。

3.流式細胞儀檢測ROS 3×108個/mL洗滌血小板分別與不同濃度PMA(0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L)或 DMSO 37 ℃孵育 30 min，加 ROS檢測探針 DCFDA(20 μmol/L)孵育10 min，經稀釋后，用流式細胞儀進行檢測。抑制實驗:3×108個/mL洗滌血小板預先與 10 μmol/L DPI、100 μmol/L MitoQ、100 μmol/L BIM、200 μmol/L DTT或DMSO 37℃孵育15 min，再與1.0 μmol/L PMA 37℃孵育30 min。

4.檢測PKC活性 3×108個/mL洗滌血小板與1.0 μmol/L PMA或DMSO 37℃孵育30 min。抑制實驗:3×108個/mL洗滌血小板預先與200 μmol/L DTT、100 μmol/L BIM 或 DMSO 37 ℃孵育 15 min，再與 1.0 μmol/L PMA 37 ℃ 孵育30 min。使用非同位素標記的PKC活性檢測試劑盒，先抽提PKC，再檢測。具體步驟按說明書操作。

三、統計學方法

結 果

一、BIM抑制 PMA誘導的 GPⅠbα酶切的分析

PMA是常用的PKC活化劑，能誘導GPⅠbα酶切。為了證實PKC在PMA誘導GPⅠbα酶切中的作用，本研究使用PKC特異性抑制劑BIM，同時使用解離素-金屬蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17)抑制劑GM6001作為對照。圖1結果顯示，BIM完全抑制PMA誘導的GPⅠbα酶切;GM6001能完全抑制PMA誘導的GPⅠbα酶切。

圖1 BIM完全抑制PMA誘導的GPⅠbα酶切

二、DTT抑制 PMA誘導的GPⅠbα酶切的分析

ROS通過氧化ADAM17的半胱氨酸殘基調控ADAM17活性［5］。為了證實 ROS是否參與PMA誘導的GPⅠbα酶切，本研究使用ROS抑制劑DTT。結果顯示DTT濃度依賴地抑制PMA誘導的GPⅠbα 酶切，在高濃度(200 μmol/L)時能完全抑制PMA誘導的GPⅠbα酶切。表明ROS參與調控PMA誘導的GPⅠbα酶切。見圖2。

圖2 DTT濃度依賴地抑制PMA誘導的GPⅠbα酶切

三、PMA濃度依賴地誘導血小板產生ROS

為了證實PMA是否誘導血小板產生ROS，本研究使用ROS檢測探針DCFDA。圖3結果顯示，PMA濃度依賴地誘導血小板產生ROS，表明PMA能夠誘導血小板產生ROS。

圖3 PMA濃度依賴地誘導血小板產生ROS

四、NAD(P)H氧化酶抑制劑抑制PMA誘導的ROS

ROS主要由線粒體呼吸鏈和NAD(P)H氧化酶產生［6］。為了證實PMA誘導產生的ROS的來源，本研究使用線粒體靶向的ROS拮抗劑MitoQ和DPI。圖4結果顯示，MitoQ不抑制PMA誘導產生ROS，而DPI則抑制PMA誘導產生ROS，表明PMA誘導產生的ROS來自NAD(P)H氧化酶。

圖4 DPI抑制PMA誘導的ROS

五、PKC抑制劑抑制PMA誘導的ROS

為了證實PMA誘導產生ROS是通過活化PKC，本研究使用BIM。圖5結果顯示，BIM抑制PMA誘導的 ROS，表明PKC參與 PMA誘導的ROS，提示PKC可能在ROS信號通路的上游。

六、ROS抑制劑不抑制PMA誘導的PKC活化

為了進一步證實PKC與ROS之間的上下游關系，本研究使用PKC活性檢測試劑盒。圖6結果顯示，DTT不影響PMA誘導的 PKC活性，而BIM則抑制PMA誘導的PKC活化。

圖5 BIM抑制PMA誘導的ROS

圖6 DTT不抑制PMA誘導的PKC活化

討 論

GPⅠbα是血小板膜受體GPIb-IX-V復合物中最重要的一個亞基，能與血管性血友病因子(VWF)、凝血酶、P-選擇素等結合，在血小板血栓形成的起始階段起關鍵作用［7］。血小板在活化的同時，伴隨有GPⅠbα酶切，產生的酶切片段稱為 GC［1］。

最近Bergmeier等［8］使用基因敲除小鼠證實ADAM17是負責酶切 GPⅠbα的主要蛋白酶。ADAM17由824個氨基酸殘基組成的I型跨膜蛋白，含有多個結構域。從N端開始包括:信號肽、前域、金屬蛋白酶域、解離素域、表皮生長因子樣域、半胱氨酸富含域、跨膜域和胞質尾［9］。已有報道，ADAM17的前域、半胱氨酸富含域、跨膜域和胞質尾參與ADAM17的活性調節［10］。其中，胞質尾在ADAM17活性調控中的調節存在爭議，有些報道認為ADAM17胞質尾的絲氨酸被p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)或PKC磷酸化引起ADAM17活性增加［11-12］;另一些報道認為胞質尾不參與調控ADAM17活性［13］。PMA是PKC活化劑，常用于ADAM17底物酶切的研究。Killock等［12］報道，PMA先活化PKC，活化的PKC直接磷酸化ADAM17胞質尾的絲氨酸，進而活化ADAM17引起底物的酶切。PMA能夠誘導GPⅠbα酶切已被很多文獻報道［3］。然而，PMA 誘導 GPⅠbα酶切的信號通路目前還未完全闡明。本研究使用各種抑制劑，結果表明在PMA誘導的GPⅠbα酶切中，可能存在“PMA-PKC-NAD(P)H氧化酶-ROS-ADAM17-GPⅠbα酶切”信號通路。本研究進一步支持ADAM17的胞質尾可能不參與調節ADAM17活性。NAD(P)H氧化酶是由5個主要亞基構成的酶復合體［14］。PKC如何引起NAD(P)H氧化酶活化本研究未涉及，可能通過直接或間接的方式，目前這方面的研究正在進行中。

近年來，ROS在調控ADAM17活性方面逐漸引起人們的關注［5］。ROS的來源主要有線粒體呼吸鏈和NAD(P)H氧化酶。本研究結果顯示，PMA通過活化PKC，PKC通過直接或間接途徑活化NAD(P)H氧化酶，產生ROS，ROS通過直接或間接的方式活化ADAM17，進而引起GPⅠbα酶切。有報道，ROS能直接通過氧化ADAM17的半胱氨酸殘基直接活化ADAM17［5］;也有報道，ROS通過活化p38MAPK進而引起ADAM17的活化［15］。ROS如何引起ADAM17活化本研究未涉及，可能通過直接或間接的方式，目前這方面的研究正在進行中。

最近的研究報道，鈣離子依賴蛋白酶(calpain)參與 A23187、凝血酶(在攪拌條件下)和calpain活化劑dibucaine誘導的GPⅠbα 酶切［16］。本研究使用calpain抑制劑MDL28170，結果發現MDL28170不抑制PMA誘導的GPⅠbα酶切，表明不同的誘導劑引起的GPⅠbα酶切涉及不同的信號通路。

綜上所述，本研究證實PMA誘導GPⅠbα酶切不是通過PKC直接活化 ADAM17，而是通過NAD(P)H氧化酶產生的ROS活化ADAM17。本研究結果有助于進一步認識GPⅠbα酶切的機制。闡明GPⅠbα酶切的機制不僅有助于認識血小板血栓形成的機理，而且為認識血小板儲存損傷提供新的視角。

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