佛波酯誘導(dǎo)血小板黏附受體GPⅠbα酶切的機(jī)制研究

王志成，羅梅宏，謝如鋒，張曉峰

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，上海200071;2.上海市血液中心血液工程室，上海200051)

血小板在活化的同時(shí)，伴隨有黏附受體GPⅠbα的酶切，產(chǎn)生的酶切片段稱為糖盞蛋白(glycocalicin，GC)［1］。GPⅠbα 酶切是血小板儲(chǔ)存損傷(platelet storage lesion，PSL)一個(gè)重要的生物標(biāo)志物［2］。因此，闡明GPⅠbα酶切的機(jī)制將有助于認(rèn)識(shí)血小板儲(chǔ)存損傷的機(jī)理。

佛波酯 (phorbol12-myristate-13-acetate，PMA)是常用的蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)的活化劑。PMA 能誘導(dǎo) GPⅠbα 酶切［3］，但是PMA誘導(dǎo)GPⅠbα酶切的分子機(jī)制尚未完全闡明。我們主要探討了PMA誘導(dǎo)GPⅠbα酶切的分子機(jī)制。

材料和方法

一、材料

1.研究對(duì)象 選取健康志愿者10名，男、女各5名，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)同意，志愿者均簽署知情同意書。

2.主要試劑 抗GPⅠbα N端單克隆抗體SZ-2、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自Santa Cruz公司;GM6001購(gòu)自Calbiochem公司;二硫蘇糖醇(DTT)、NAD(P)H氧化酶抑制劑(DPI)、蛋白激酶 C(PKC)抑制劑(BIM)、佛波酯(PMA)、ROS檢測(cè)探針DCFDA購(gòu)自Sigma公司;PKC活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司;線粒體活化氧(ROS)拮抗劑MitoQ購(gòu)自蘇州沃盛化學(xué)有限公司。

二、方法

1.制備洗滌血小板 取健康自愿者靜脈血，用檸檬酸鹽緩沖液(ACD)按照1∶7抗凝，380×g離心20 min得到富含血小板血漿(PRP)，PRP經(jīng)1 500×g離心20 min，沉淀用葡萄糖檸檬酸鹽緩沖液(CGS)緩沖液懸浮，經(jīng)離心、洗滌，最后用MTB液重懸，得到洗滌血小板，調(diào)整血小板濃度為3×108/mL，室溫靜置1 h使其恢復(fù)至靜息狀態(tài)以備用［4］。

2.Western blot檢測(cè) GPⅠbα酶切片段 3×108個(gè)/mL洗滌血小板與1.0 μmol/L PMA或二甲基亞礬(DMSO)37℃孵育30 min，2 600×g離心5 min，得到上清，加入5×上樣緩沖液和β-巰基乙醇，最后樣品經(jīng)western blot檢測(cè)GPⅠbα酶切片段。抑制實(shí)驗(yàn):3×108個(gè)/mL洗滌血小板預(yù)先與100 μmol/L BIM、DTT(25、50、100、200 μmol/L)或DMSO 37℃孵育15 min后，再與1.0 μmol/L PMA 37℃孵育30 min。……