兩種檢測系統測定血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的偏差評估

戴 悅，吳文清

(1.上海市第八人民醫院檢驗科，上海200235;2.復旦大學附屬華山醫院檢驗科，上海200040)

近年來已有許多實驗證明半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C，Cys C)是檢測腎功能的新的內源性標志物［1-2］。Cys C在臨床診斷以腎病為主的疾病具有非常重要的價值。越來越多的實驗室已開展了Cys C的測定。全自動生化分析儀應用的原理是液相透射比濁法，而特定蛋白分析儀應用原理是顆粒增強散射比濁法。由于檢測原理和儀器不同，不同方法的結果可能有所差異。為了解液相透射比濁檢測系統和顆粒增強散射比濁檢測系統測定結果偏差的大小，我們按美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)EP9-A2文件［3］，對以上2種檢測系統進行了方法對比和偏差評價。

材料和方法

一、材料

1.儀器 羅氏MODULAR P800全自動生化分析儀(簡稱P800)和西門子BN-Ⅱ特定蛋白分析儀(簡稱BN-Ⅱ)。

2.試劑及定標品 液相透射比濁檢測系統使用廣東虹業抗體科技有限公司提供的Cys C透射比濁檢測試劑盒(批號:20120301)，配套定標品、質控品。顆粒增強散射比濁檢測系統使用由西門子公司提供的Cys C測定試劑盒(產品編號:OQNM13，批號:40706)。定標品:N蛋白定標品UY，批號49854。質控品:伯樂52390。

3.樣本收集 從上海市第八人民醫院檢驗科采集的門診及住院患者的標本中，按EP9-A2文件中對比要求選取一定濃度范圍內的新鮮血清40份。

二、方法

每天選取8份臨床患者當日樣本，分別置于樣本盤1～8號位置上，用2種檢測系統對其進行雙份平行測定。測定順序為1→8，8→1。以上步驟重復5 d。實驗結束后質控分別在控當天實驗結果才被采用，有一方失控，結果不予采納，找到失控原因后第2天進行重復測定。比對方法參考NCCLS EP9-A2文件(用患者樣本進行方法對比以及偏倚評估)。本研究以BN-Ⅱ(顆粒增強散射比濁系統)作為對比系統(X變量)，以廣東虹業抗體科技有限公司提供的Cys C試劑盒和P800組成的液相透射比濁系統作為測試系統(Y變量)，對兩者數據進行比對分析。

三、統計學方法

統計學分析方法按偏倚評估程序進行。初步數據檢查:計算每種方法的各個樣本雙份測定間差值的絕對值，并以絕對差均值的4倍為可接受限進行數據檢查;X變量取值范圍的檢查:修正系數r作為評價X變量范圍是否足夠寬泛的評價指標;線性回歸分析按下列方程進行描述:Y=bX+a;計算預期的偏差和可信區間;作圖運算采用Microsoft Office Excel程序軟件分析。

結 果

一、初步數據檢查

1.方法重復測試的離群點檢查 為了研究是否有單獨的數據點落在范圍之外，需要進行方法內重復測試的離群點檢查。數據詳見表1。所有數據都要進行離群值檢查，計算可接受限。如果有數據點落在范圍之外，則必須對該差異的產生進行分析調查，并且將落在范圍之外的數據點從數據庫內刪除，重新計算可接受限。當有2個以上的數據點被刪除，需要對此產生的原因進行分析，找到原因后將數據補充完整。如果既沒有找出原因，也無法通過調整重復性測定間的最大差異的手段進行調整，則需要停止實驗并通知廠商。經過計算，本研究數據均在可接受限范圍內。

表1 離群點檢查

2.離群點和非連續性變量對2方法比較的影響 為了消除非線性關系，離群點和非連續性變量對2系統比較的影響，需要作圖進行檢查，觀察2系統測定的數據之間是否具有線性關系。由于長期以來，BN-Ⅱ都具有一定的穩定度和準確性保證，因此將BN-Ⅱ測定數據作為橫坐標，P800測定數據作為縱坐標。從圖1中可以觀察到2種系統數據呈線性關系。此外在散點圖的基礎上加了一條通過原點，斜率為1.0的直線。由此圖中觀察到，數據并非均勻分布在直線兩邊，而是集中偏向一側。提示數據之間可能存在偏倚，即P800的測定結果高于BN-Ⅱ的結果。

圖1 P800和BN-Ⅱ測定結果的散點圖

3.2種檢測系統的偏差 以［BN-Ⅱ均值(X)+P800均值(Y)］/2得出的數值為橫坐標，以P800均值(Y)減去BN-Ⅱ均值(X)得出的數值為縱坐標。將均數作為橫坐標能更直觀的觀察到整個數據的分布。由圖2可見，2種檢測系統數據間存在正偏倚。

圖2 BN-Ⅱ與P800結果的偏差圖

二、2方法的線性回歸分析

按照NCCLS EP9-A2文件，r≥0.975或 r2≥0.95則認為標本的取值范圍足夠寬，其測定誤差對回歸估計的影響可忽略不計，可用直線回歸計算斜率和截距。通過直線回歸計算得到結果為Y=1.216X-0.139，r2=0.978。可以認為測定范圍合適，同時2種檢測系統間線性關系較好。

三、計算預期偏差和可信區間

根據臨床使用要求，選擇參考區間(0.53～0.95 mg/L)2個端點和試劑的線性范圍達到的水平7.85 mg/L作為3個醫學決定水平，結合線性回歸方程來評估2種檢測系統間的預期偏差和95%可信區間。由于美國臨床實驗室改進修正法案(CLIA'88)中并沒有規定Cys C的可接受誤差范圍，因此以1/2本實驗室規定的允許誤差(TEa=20%)為限。Cys C濃度在0.53、0.95 mg/L時的預期偏差能接受，而濃度在7.85 mg/L時的預期偏差不可以接受。見表2。

表2 Cys C的預期偏差和95%的可信區間

討 論

Cys C是一種半胱氨酸酶抑制物，相對分子質量為13 250，可由所有有核細胞產生。隨著其在臨床上的廣泛應用和研究的深入［4］，Cys C檢測方法也在不斷進步［5］。要實現同種項目在不同分析系統中的檢測結果具有可比性是實驗室也是質量管理的最終目的。

不同檢測系統影響Cys C測定結果差異因素主要由于方法學差異，測定程序校準差異，不精密度差異，試劑差異，儀器漂移故障等［6］。ISO15189(醫學實驗室——質量和能力的專用要求)和IS0/IEC17205(檢測和校準實驗室能力的通用要求)明確提出了醫學實驗室檢測結果的溯源性和可比性。強調方法學比對實驗是實現準確度溯源和患者樣本檢驗結果可比性的重要途徑［7］。

本研究依據NCCLS EP9-A2文件對血清Cys C 2種檢測系統進行方法學對比和偏差評估。結果顯示2種檢測系統的測定結果具有較好的相關性，與文獻［8］結果基本一致。在0.53、0.95 mg/L濃度時，允許誤差在95%可信區間范圍內，預期偏差能接受。而在7.85 mg/L濃度時，允許誤差＜95%可信區間下限，提示2種檢測系統得出得結果不具一致性，預期偏差不可以接受。EP9-A2文件(2002)與 EP9-A文件(1995)［9］的不同之處在于EP9-A2文件是計算預期偏差的95%可信區間，并判斷 ^Bc的95%可信區間與可接受誤差的關系，替代了EP9-A文件中用相對偏差(在Xc濃度上偏差的百分比)來判斷偏差是否可接受。如按照EP9-A用相對偏差來判斷偏差時，分別計算各濃度水平得出相對偏差分別為4.72%、6.95%、19.8%(相對偏差=︱(給定值—預期值)︱/給定值×100%)，均＜允許誤差(TEa=20%);而由此得出的結論是各濃度水平的預期偏差均能接受［10］。可見，隨著濃度的增加，相對偏差均增大。但是在高濃度，計算預期偏差時，EP9-A2文件與EP9-A文件得出的結論不同。

造成2種檢測系統測定結果之間差異的主要原因可能是由于標準化溯源性的差異［11］。根據廠商提供的資料顯示，2種檢測系統中Cys C參考物質都是由各自廠商所制備的高純度蛋白，且沒有追溯至國際認證的一級參考物質(ERMDA471/IFCC)［12］。另外，有研究表明即使在測量相同的量時，透射比濁法與散射比濁法2種不同的測量程序也會提供不同的結果［13］。因此要實現Cys C測量程序標準化也是十分重要的。

綜上所述，雖然2種檢測系統之間有所差異，但在測定低濃度樣本時，還是能保證兩者測定結果的一致性。在高濃度樣本時，應注意兩者測定結果的偏差。

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