兩種培養方法檢測解脲脲原體及其菌落形態學的比較研究

周運恒，馬紅霞，曹廣亞，石曉星，劉風華

(1.警上海市總隊醫院檢驗科，上海201103;2.上海市東方醫院體驗中心，上海200120)

解脲脲原體(ureaplasma urealyticum，Uu)是泌尿生殖道感染較為常見的病原微生物之一，在特定的條件下可以致病，可引起非淋菌性尿道炎(nongonococcal urethritis，NGU)、宮頸炎、前列腺炎、不孕不育癥等，其致病性與宿主免疫力、Uu的血清型或基因型等因素有關。目前Uu檢測主要是采用液體培養法，已經沿用近20年，但在臨床中已暴露出很多缺陷，如假陽性率高［1］、假陰性以及污染干擾嚴重［1］等。固體瓊脂法可以觀察支原體特征性的菌落，如“海膽型”或“油煎蛋樣”菌落是微生物學診斷的金標準。但由于操作煩鎖、培養時間長以及試劑有效期短等原因，目前國內外臨床上僅有少數醫院在應用，且支原體形態和菌落較難辨認，所以對Uu形態學的研究較少。本研究采用選擇性固體培養基-液體培養基一步法比較2種培養方法檢測Uu結果的差異，并觀察男女不同類型標本中Uu菌落形態學的差異。

材料和方法

一、材料

1.研究對象 2011年3至9月武警上海市總隊醫院門診婦科、皮膚科、不育不孕科及泌尿外科就診患者共1 698例。其中，女性宮頸分泌物標本1 030例，男性尿道分泌物標本156例，精液標本512例。

2.試劑 支原體液體培養基由鄭州安圖綠科生物工程有限公司提供，Uu選擇分離培養基由河北微拉生物科技有限公司提供，用OLYMPUS CR21顯微鏡觀察并拍照。標準菌株為Uu(ATCC 27813)，由鄭州安圖綠科生物工程有限公司提供。

二、方法

1.標本采集 男性患者的尿道拭子:消毒尿道口后自行由內向外擠壓陰莖數次，用無菌小棉拭子蘸取無菌生理鹽水少許輕輕插入尿道口1～2.5 cm處，360°輕轉3～5圈蘸取分泌物，將取樣后的棉拭子插入專用無菌試管中。精液:按照常規方法取出，禁欲3～7 d后手淫或取精器取精液于干燥消毒量杯內(收集標本前排尿，并用無菌水清洗尿道口)，置37°C水浴箱內液化。女性患者:采樣前3 d內未使用陰道內藥物或沖洗陰道，24 h內無性行為，避開月經期采集;采集時常規消毒外陰，用陰道窺器擴張后，先用無菌棉球清除宮頸口分泌物，另取小棉拭子蘸取無菌生理鹽水少許插入患者宮頸口1～2 cm處單層柱狀上皮細胞，360°輕轉3～5圈，停留片刻取出，放入配套的無菌容器中，立即送檢。

2.直接接種法 將取材后的拭子或液化后的精液在固體選擇分離培養基表面涂抹接種，并放入CO2發生片;然后接種分泌物標本或液化后的精液于支原體基礎培養液中，在37℃孵箱內培養。所有操作步驟均嚴格按照說明書進行。

3.結果判斷 液體培養基判斷標準:培養48 h，液體培養基由黃色變成紅色和橙紅色，凡≥104CFU/mL鑒定孔試劑變色為Uu陽性的篩選對象，＜104CFU/mL為攜帶者或無致病意義。固體培養基陽性判斷標準:培養48 h，用顯微鏡在低倍鏡下觀察固體培養基支原體的菌落生長情況，以看到固體培養基上生長的支原體菌落(如“海膽型”或“油煎蛋樣”等)作為陽性的確診標準，形態學可疑時可以延長培養至72～168 h再觀察。一般情況下，Uu菌落較小，圓形，棕褐色;人型支原體菌落較大，無色，有寬大透明周邊帶環繞的油煎蛋樣。

三、統計學方法

數據用 SPSS 15.0軟件進行 χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、支原體感染陽性率

液體培養法與固體培養法相比，女性宮頸分泌物標本Uu陽性率差異有統計學意義(P＜0.05)，而男性精液和尿道分泌物標本Uu陽性率之間差異無統計學意義(P＞0.05)。以固體培養法為標準判斷，發現女性生殖道分泌物標本的Uu陽性率最高(49.9%)，明顯高于男性精液和尿道分泌物標本(P均＜0.05)。見表1。

表1 2種方法培養不同類型標本支原體陽性率結果

二、固體培養基上不同類型標本支原體形態學觀察

Uu菌落存在多形性，主要的菌落形態有:海膽型(形似海膽，棕黑色，圓形或不規則形，大小不等，內部有布紋樣結構，單個或多個菌落聚集在一起)、油煎蛋型(形似油煎蛋，棕黃色，圓形，核心顆粒致密)、空泡型(邊緣顆粒致密呈棕黑色，內部無色疏松)、微小型(菌落較小，棕黑色)、棒狀(棕黑色，長短、粗細不等)，而且同一種菌落在不同類型標本中其菌落大小和數量等方面也不完全一致。見圖1、圖2。

三、不同類型標本Uu菌落形態分布

在3種不同類型標本中，Uu菌落形態均以海膽型菌落為主(77.5%)，其次是油煎蛋樣(13.8%)，而微小型、空泡型和棒狀較少見，另外存在2種以上形態的混合型菌落。見表2。

圖1 女性宮頸分泌物中Uu形態(×100)

圖2 精液標本中Uu形態(×100)

表2 不同類型標本Uu菌落形態分布

討 論

傳統的支原體分離培養過程應有2個部分，肉湯增菌和濾液轉種，觀察其菌落形態，然后進行Diense染色和生化反應最終報告。但間接轉種法由于轉種的時間選擇不當也存在一定的假陰性。由于固體培養法操作和觀察結果繁瑣，在上海地區幾乎沒有醫院采用固體培養法，而且有的液體培養法不做定量計數和藥物敏感性試驗。據吳磊等［2］報道在2008年上海市共有124家臨床實驗室參與Uu室間質控，結果顯示Uu陽性標本、干擾菌和陰性模擬物3種標本均符合的只有39家，可見試劑質量參差不齊。本研究采用的是一步培養法，與傳統的二步法相比可以節約時間，減少工作量，而且操作方便，利用劃痕能容易在瓊脂層表面找到支原體菌落［3］。一些小樣本研究發現固體培養法與液體培養法相比在陽性率結果方面存在爭議，而且多以女性的標本為主，沒有按照標本類型分別研究［4-5］。我們通過1 698例大樣本研究發現在檢測女性Uu陽性率時，液體培養法的陽性率要高于固體培養法，而對于男性標本，兩者差異無統計學意義。可能是由于男、女性泌尿生殖道Uu寄存環境的差異，一步法與兩步法假陰性的差異以及試劑廠商不同、抑制細菌的能力和檢測率差異所致。

本研究發現，液體培養法存在較高的假陽性，尤其是女性宮頸分泌物標本，男性精液和尿道分泌物標本液體培養法雖然也存在一定的假陽性，但與固體培養法相比差異無統計學意義。主要原因可能是男女生殖道寄居或感染分解尿素的細菌不同所致［6］。另外標本中某些酵母菌和葡萄球菌的污染以及堿性標本也是液體培養法假陽性增加的原因。據曹愛國等［7］研究報道，液體培養基的假陽性率在20%左右。我們發現有6.3%(65/1 030)的女性患者Uu液體培養法結果僅陽性對照孔變色或半定量結果≤104CFU/mL，但在固體培養基上可以觀察到典型的支原體菌落。這種假陰性可能是:標本分泌物量少或接種量少、標本未及時接種而引起支原體死亡以及不分解尿素的支原體存在所致。

本研究女性宮頸分泌物標本中Uu感染率(49.9%)明顯高于男性精液(39.6%)，與夏晴晴等［8］報道的女性生殖泌尿道支原體的感染率基本一致。這可能與男性寄居或感染的菌株型別不同，女性的生理解剖學特殊而更易感染Uu，或者是與女性到醫院的就診率較高有關。男性精液感染率較高，可能與患者多來自不孕不育科有關，而不育不孕癥患者Uu陽性率要顯著高于一般人群［9-10］。而男性尿道分泌物中 Uu感染率最低(19.2%)，明顯低于文獻中報道的感染率，可能與患者類型、分泌物標本量少直接影響結果有關。由于尿道感染支原體容易治愈，而前列腺和附睪感染的支原體不容易治愈，因此李志軍等［11］建議男性泌尿生殖道感染的首診和復查患者宜采用精液檢測支原體，不容易漏診。

文獻和教科書中一般認為Uu的菌落形態是海膽型或油煎蛋樣。本研究中Uu主要是以典型的海膽型菌落為主，也存在油煎蛋樣、空泡型、微小型、棒狀和混合型等其他不同形態。這種異質性的主要原因是由于不同菌株生長特性和生化反應的差異導致菌落數量和形態學的差異。Uu根據分子生物學特征被分成14個血清型或2個生物群［12］。另外不同標本中因支原體含量的差異，培養基營養成分和培養條件如氣壓、濕度的不同而呈多形性［13］。潘展硯等［14］觀察了99例 Uu菌落，發現主要菌落形態為海膽型，形態的異質性與細菌性陰道炎致病性有關。我們在臨床上發現男女Uu菌落形態學存在一定的差異，可能主要是由于Uu寄生的環境生物學特性差異以及寄居在男女生殖泌尿道的Uu的型別不同所致［15-17］。

因此，固定培養基和液體培養基聯合檢測，觀察培養基顏色變化和菌落特征，可以提高Uu檢測的特異性和敏感性，降低假陽性率和假陰性率，更好地為臨床診治提供客觀的依據。但是2種培養方法的共同缺點是耗時長，不利于疾病的快速診斷和治療，而且不能對支原體進行分型，尤其是固體培養法操作較煩鎖，今后可將標本類型、菌落形態學與基因分型結合起來，通過大批量樣本來系統研究不同類型的Uu與致病性或耐藥性的關系，對于Uu感染的流行病學調查、診斷與防治將具有更重要的意義。

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